可同时进行单细胞RNA测序和胞外蛋白质检测的技术揭示了与疾病相关的新细胞类型和状态。
蛋白质是细胞的主力军，参与了细胞结构和功能的各个方面。蛋白表达谱能帮助定义细胞的类型和状态。RNA转录本通常被用于表征蛋白表达，但众所周知，蛋白质和mRNA的丰度不是简单的一对一关系。转录后调控、翻译和蛋白质降解都会导致蛋白质和mRNA的丰度出现差异。
带有DNA标签的抗体可以检测蛋白质，并通过测序读取结果。来源：Ella Maru Studio, Inc.
纽约西奈山伊坎医学院的免疫学家Adeeb Rahman说：“看到常规测序技术可能遗漏的信息令人大开眼界。”Rahman正在开发新的方法来监测疾病相关分子特征并发现新的生物标志物和药物靶点。他解释说：“在某些情况下，一些细胞类群明显在表达一种特定的蛋白，但我们可能只在其中5%-10%的细胞内检测到了相应的转录本。”
Rahman等人正在使用CITE-seq（通过测序的转录组和表位细胞索引）和REAP-seq（RNA表达和蛋白质测序分析）等技术研究RNA转录本和蛋白之间的关系，鉴定与疾病相关的新的细胞类型和细胞状态。这两种方法都将抗体-寡核苷酸与现有的单细胞RNA测序（scRNA-seq）相结合，以测定单个细胞内基因和细胞表面蛋白的表达水平。
CITE-seq和REAP-seq的一个主要优势在于，如果有合适的抗体，即便RNA丰度很低，也可以检测到其编码的目标蛋白。Rahman解释说：“CITE-seq使我们对一种特定细胞类型中存在的目标标记更有信心了。”
数十年来，研究人员利用流式细胞术检测单个细胞中的蛋白，并根据蛋白表达模式来表征细胞类型。流式细胞术依赖于检测目标蛋白的抗体。这意味着为了得到有用的信息，研究人员需要知道自己在找什么。
近年来，单细胞测序成为凭借基因表达模式确定细胞类型和状态的首选方法。单细胞RNA（或DNA）测序的一个优势是该方法的无偏性——无需任何关于细胞类型的RNA（或DNA）的先验知识，就可以通过测序仪得到其基因组或转录组谱。单细胞基因组学的进步使诸如人类细胞图谱计划（Human Cell Atlas Project）之类的大规模项目成为可能，该计划旨在创建人体内37万亿个细胞的完整参考图谱。
现在，通过提供蛋白和RNA表达的详细信息，CITE-seq和REAP-seq使研究人员可以填补流式细胞术和单细胞RNA-seq留下的空白。
领导哥伦比亚大学精准医学计划和纽约基因组中心的著名生物化学家和生物物理学家Tom Maniatis说：“多模式单细胞测序技术的进步为研究疾病的生物学机制创造了前所未有的机会。”将单细胞DNA或RNA测序与能提供调控基因表达，蛋白质表达，遗传突变，细胞谱系甚至是分子事件时空顺序的详细信息的方法相结合，不仅使我们能创建更精确的人类细胞图谱，还可以为癌症演化、神经变性、免疫系统对疾病的应答提供新的见解。
多模式单细胞测序的实际应用
在CITE-seq和REAP-seq技术中，细胞与连接了可识别蛋白质类型的寡核苷酸条形码的细胞表面抗体一起孵育，以及一段作为RNA测序起点的腺嘌呤碱基（见图）。这两种技术在DNA条形码连接到抗体的方式上有所不同，但两种技术对蛋白质的检测能力都与流式细胞术一样强大。
为了验证CITE-seq技术，纽约基因组中心的开发人员和纽约大学Lagone健康中心的科学家使用它来同时分析人类和小鼠免疫细胞的转录组和13种细胞表面蛋白。他们的分析表明，CITE-seq不仅可以正确识别不同的免疫细胞类群，还有助于表征已知的细胞亚型。通过CITE-seq技术，他们可以鉴定出疾病状态下不同天然杀伤细胞亚群在免疫应答调控中的不同作用，而仅使用单细胞RNA-seq方法是无法检测到这些作用差异的[1]。
REAP-seq技术首先被用于检测一个T细胞亚群对药物的反应，该药物通过靶向一种细胞表面蛋白来激活免疫系统攻击并杀死小鼠的癌细胞。在给药和未给药的细胞中，蛋白和基因表达的差异为药物的作用机理提供了新的见解[2]。
自这些研究发表以来，已有200多种寡核苷酸偶联抗体可用于CITE-seq和REAP-seq技术。这些抗体已经被用于评估晚期肺癌患者经免疫治疗后的免疫细胞活化[3]，并被用于研究与临床脑血管疾病相关的动脉粥样硬化部位的免疫失调。当Rahman和同事使用CITE-seq分析脑卒中患者动脉粥样硬化病变中的免疫细胞类型时，他们发现与血液中的T细胞亚群相比，这些免疫细胞的活化、分化和耗竭性更高。利用这些技术来表征免疫细胞或有助于设计个性化疗法，帮助预测患者对治疗的反应[4]。
扩展多模式测序工具箱
利用与DNA条形码相同的概念，纽约基因组中心的Peter Smibert和NevilleSanjana对CITE-seq技术进行了扩展，试图从单细胞中揭示更多的信息。ECCITE-seq（通过测序扩展CRISPR兼容的转录组和抗原表位的细胞索引）技术可以同时检测转录组、蛋白质、克隆型和CRISPR扰动[5]。
耶鲁医学院的分子病毒学家Ya-Chi Hot致力于研究HIV如何在细胞中持续存在，她说：“我爱这项技术。“感染HIV的细胞数量很少：外周血中只有不到1％的T细胞含有这种病毒。而且，没有任何标志物能将感染HIV的细胞与未感染的细胞区分开，导致这些细胞无法被检测或分析。
ECCITE-seq可以识别T细胞受体序列的差异，这种差异赋予了特定抗原其特异性。这些序列位于RNA分子的5''端，很难用对RNA3''端进行分析scRNA-seq方法进行检测。此外，该技术扩展后可用来检测同一细胞内HIV的RNA。她解释说：“ECCITE-seq能让我们解决异质性、稀有性，以及这些细胞缺乏标记的问题，可谓非常强大。”
Ho和她的团队目前正在研究高水平病毒血症期间和抗逆转录病毒治疗后HIV感染者血液中的细胞，以确定感染的细胞如何能够继续分裂，从而导致HIV阳性细胞的克隆扩增。了解这些抗性克隆的特征可以为靶向携带HIV的细胞并有效治愈HIV的新疗法提供线索。
分子神经科学家Abbas Rizvi与哥伦比亚大学的Maniatis及其同事合作，结合其他单细胞测序技术来开发全面的人类脊髓细胞图谱。他们利用RNA-seq和ATAC-seq（染色质转座酶可及性测序）技术，在死后脊髓细胞的细胞核中识别活性转录调节元件，以开发针对脊髓疾病和损伤的新疗法。
Rizvi与生物信息学家和统计学家紧密合作，以开发数学方法来统筹数据。他解释说：“多模态策略使我们能够将任何细胞类型中同时收集到的不同测量指标关联起来，从而破译与神经回路发展、建立和维持相关的关键分子事件。”
在比较来自脊髓的颈、胸、腰部的细胞的转录表达模式时，研究团队发现了显著的差异。 Maniatis说：“最终，我们希望对肌萎缩性侧索硬化症患者的脊髓进行同类型分析，以了解运动神经元退化的潜在机制，确定新的治疗靶标。”
计算工具对于从新测序技术产生的数据中发掘生物学意义至关重要。Rizvi指出，这些工具正在引发单细胞技术的“第二波热潮”。Maniatis也认为，“现在我们可以开始以前所未有的方式真正了解神经退行性疾病的复杂性，以及多种基因和基因变异对疾病进程的贡献。”
未来展望
对细胞内容物进行条形码编码可以使研究人员从单细胞中得到多重信息。与仅使用转录组测量数据相比，这样可以更详细地表征细胞表型。这些多组学信息具有巨大的潜力，可以促进转化基因组科学和精准医学的发展。
Rizvi说：“我们对空间转录组学方法的发展感到兴奋，该方法将单细胞RNA测序数据置于其解剖学背景中。”这将有助于识别易发生神经元变性的细胞，并确定其周围可能影响疾病进程的细胞特征。
当前，单细胞多组学技术主要用于识别不同数据类别之间的相关性。但是很快，通过将它们与实验扰动结合起来，就有可能发现因果关系。
通过测序检测蛋白质需要大量预先优化的抗体。目前，对于可通过CITE-seq检测细胞外蛋白的抗体来说，其数量似乎不受技术限制。允许抗体进入细胞的温和透化方法或使研究人员将来能够对细胞内蛋白进行测序。Maniatis说：“这样的改进将大大提高该方法在其他系统中的功能性和适用性。”
随着CITE-seq和ECCITE-seq抗体的日益普及，Rahman期望这些方法将被迅速推广使用：“如果你已经在做单细胞RNA-seq，那么添加CITE-seq会使您以较低地投入获得更多的数据。”
参考文献：
1. Stoeckius,M. et al. Nat Methods 14, 865–868 (2017)
2. Peterson,V. et al. Nat Biotechnol 35, 936–939(2017)
3.Chin,V. T. et al. J Clin Onc 37, 15_suppl e20563 (2019)
4. Fernandez,D.M. et al. Preprint at bioRxivhttps://doi.org/10.1101/721688 (2019)
5. Mimitou,E. P. et al. Nat Methods 16, 409–412 (2019)
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