缬沙坦是血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)、联苯四氮唑结构的沙坦类化合物,用于各类轻中度高血压的治疗,尤其适用于ACE抑制剂不耐受的患者。2018年7月,药品监管部门首次在含有缬沙坦的产品中发现亚硝胺杂质——N二甲基亚硝胺(NDMA)。随后在沙坦类其他药物和雷尼替丁中都检测到各类亚硝胺杂质,例如N-二乙基亚硝胺(NDEA)、N-二异丙基亚硝胺(NDIPA)、N-乙基异丙基亚硝胺(NEIPA)和N-亚硝基二丁胺 (NDBA)。因此,对使用缬沙坦原料药的药品进行了全球召回,导致缬沙坦药品暂时短缺。
图1 N-亚硝胺的分子结构
根据世界卫生组织 (WHO) 的国际癌症研究机构 (IARC)的研究,大多数亚硝胺会对动物和人类具有致癌和遗传毒性。沙坦类药物大多含有四唑环,四唑环的形成需要亚硝酸钠;药物的生产设备、生产用试剂和溶剂(例如普通溶剂DMF中的二甲胺)也可能会带来污染,都有可能形成亚硝胺。欧洲药典 (Ph. Eur.) 委员会将 API 中亚硝胺的临时限值设定为低于 1 ppm,且于2020年底降至30 ppb。
低限值设定就需要使用灵敏度高和选择性好的分析方法。本应用参照美国FDA指南的方法进行优化,通过GC/MS/MS在EI源 MRM模式下痕量检测缬沙坦药品中的5种亚硝胺杂质 (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA),并根据USP要求进行方法学验证。
GC-MS/MS 方法检测不同的亚硝胺化合物,使用液体直接进样方式。与FDA方法相比,选择了膜厚更薄(0.5µm而不是1µm)的Supelcowax®柱,符合USP通则中<621>色谱法的规定。色谱条件以及质谱条件见表1-3。
表1 色谱条件
色谱柱
SUPELCOWAX® 10, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.5µm (24284)
检测器
MS/MS
进样口温度
250℃
柱温箱程序
40℃保持0.5min,20℃/min至200℃, 60℃/min 至250℃保持3min
载气及流速
氦气,1.0mL/min
衬管
4 mm单径锥衬管带玻璃棉
进样量
2 µL
样品稀释剂
二氯甲烷
样品制备
使用切片工具,取药片的四分之一放入15mL离心管,加入5mL二氯甲烷。将样品涡旋1分钟,并置于离心机中以4000 rpm离心2.5min。取二氯甲烷层上清液2mL,用0.45µm PVDF膜过滤。取续滤液0.5mL到2mL样品小瓶中并加盖。
标准溶液
二氯甲烷作为溶剂,配制得到浓度分别2.5、5.0、10、20、40、80、100ng/mL的5种亚硝胺(NDMA/NDEA/NEIPA/NDIPA/NDBA)校准溶液。
表2 质谱条件
调谐
自动调谐
离子源及采集模式
EI源,MRM
碰撞气体
氮气 @ 1.5mL/min
淬灭气体
氦气 @ 4.0mL/min
溶剂延迟
7 min
离子源温度
230°C
四极杆温度
150°C
电离电压
70 eV
驻留时间
50 ms
表3 MRM 离子对参数列表
峰
化合物
Transiton
保留时间
1
N二甲基亚硝胺MRM2
74→42
6.952
N二甲基亚硝胺MRM1
74→44
6.952
2
N-二乙基亚硝胺MRM 1
102→85
7.533
N-二乙基亚硝胺MRM2
102→56
7.528
3
N-乙基异丙基亚硝胺MRM1
116→99
7.784
N-乙基异丙基亚硝胺MRM2
71→56
7.787
4
N-二异丙基亚硝胺MRM1
130→42
7.971
N-二异丙基亚硝胺MRM2
130→88
7.976
5
N-亚硝基二丁胺MRM1
158→99
9.497
N-亚硝基二丁胺MRM2
84→56
9.494
五种亚硝胺化合物在10分钟内完全分离,且目标峰与溶剂和基质杂质得到了很好的分离(图 2)。由于使用了0.5µm膜厚的色谱柱,与 FDA 方法相比,分离时间更短。
图2 40 ng/mL系统适用性溶液色谱图,峰表见表3.
实验得出:N-二乙基亚硝胺(NDEA)和N-二异丙基亚硝胺(NDIPA)的多反应监测MRM Transition最低检测限浓度为2.5ppb,如图3所示。
图3 NDEA(上图)和 NDIPA(下图)最低检测限谱图
经验证的 FDA-OTR 方法要求 40 ng/mL 标准品六次重复进样的 RSD%≤ 5%。使用我们的方法,连续6次进样 40 ng/mL 的5种亚硝胺杂质,在两种 MRM 下的 RSD%远小于 5,如表4所示。
化合物
MRM1 RSD%
MRM2 RSD%
N二甲基亚硝胺
1.8
1.3
N-二乙基亚硝胺
1.1
1.1
N-乙基异丙基亚硝胺
4.2
1.5
N-二异丙基亚硝胺
0.9
2.2
N-亚硝基二丁胺
4.3
3.0
表4 40ng/mL 亚硝胺标准品连续六次进样的精密度
此外,线性校准曲线的相关系数R2应≥ 0.998。本方法中五种亚硝胺杂质的两个 MRM都超过了这一标准(表 5)。
杂质
MRM 1
MRM 2
N二甲基亚硝胺
0.9994
0.9995
N-二乙基亚硝胺
0.9991
0.9995
N-乙基异丙基亚硝胺
0.9995
0.9995
N-二异丙基亚硝胺
0.9996
0.9994
N-亚硝基二丁胺
0.9983
0.9981
表5 两种MRM定量中两种亚硝胺的相关系数 (R2)
在药店购买的缬沙坦药品中加入亚硝胺杂质,浓度为10 ppb(NDBA为40 ppb),5种亚硝胺的回收率在94.5%~105.7%之间。(表6)。
杂质
10ppb回收率
NDMA
99 %
NDEA
103.5 %
NEIPA
94.5 %
NDIPA
103.9 %
NDBA
105.7 %
表6 缬沙坦药品中5种亚硝胺的加标回收率
对于缬沙坦药品中5种亚硝胺的检测,FDA 方法的定量限 (LOQ) 范围是 8 – 40 ppb,本实验方法的 LOQ见表 7。LOQ 是根据每种化合物校准曲线信噪比 (S/N) 为 10 浓度计算得出的,并且通过缬沙坦片剂的标准添加实验进行了验证。检出限LOD是信噪比 (S/N) 为 3 的浓度计算得到 。
杂质
FDA方法 LOQ [ppb]
本实验方法LOQ [ppb]
NDMA
133
NDEA
85
NEIPA
83
NDIPA
85
NDBA
4032
表7 FDA和实验方法LOQ结果
综上,参考FDA 建议方法,使用 SUPELCOWAX® 色谱柱通过 GC-MS/MS在 MRM 模式下可以轻松实现亚硝胺杂质的测定。所有亚硝胺化合物之间以及与溶剂和基质峰的分离良好,满足所有系统适用性要求。该方法已成功应用于缬沙坦药物中亚硝胺类杂质的分析。
描述货号
SUPELCOWAX® 10 气相毛细管柱30 m × 0.25 mm,0.50 μm
24284
SupraSolv® GC-MS二氯甲烷
1.00668
N二甲基亚硝胺NDMA认证参考物质 5000 µg/mL甲醇溶液
CRM40059
N-二乙基亚硝胺NDEA 认证参考物质 5000 µg/mL甲醇溶液
40334
N-亚硝基二丁胺NDBA 分析标准品
442685
N-乙基异丙基亚硝胺NEIPA EP标准品
Y0002262
N-二异丙基亚硝胺NDIPA EP 标准品
Y0002263