摘要
纳武利尤单抗（Nivolumab）是一种全人免疫球蛋白 G4，用于治疗几种晚期实体癌，作为免疫检查点抑制剂。血浆中 mAb 的定量存在一些挑战，因为 IgG 固有地存在于复杂的生物基质中，这种测定必须基于可靠、选择性、 和准确的分析方法。本研究描述了在两个独立实验室中进行的两种经过验证的方法，一种是使用三重四极杆串联质谱 (LC-MS/MS) 开发的，另一种是使用轨道阱系统 (LC-MS/HRMS) 开发的高分辨率质谱。两种方法都使用全长稳定同位素标记的 nivolumab 样（精氨酸 13C6-15N4 和赖氨酸 13C6-15N2）作为内标。样品制备基于 IgG 免疫捕获，然后进行胰蛋白酶消化，并以阳性模式定量一种替代肽。对于LC-MS/HRMS和 LC-MS/MS，测定分别在 5–100 μg/mL 和 5–150 μg/mL 范围内显示出良好的线性。LC-MS/HRMS 和 LC-MS/MS 的定量限分别设定为 2 和 5 μg/mL。两种方法也获得了可接受的准确度（从 - 13.6% 到 3.0%）和精密度（20% 以内）值。两种 LC-MS 方法显示出非常不同的基质效应，这与使用不同的分析柱和洗脱梯度有关。
关键词：Nivolumab；LC-MS/HRMS ；LC-MS/MS；Strata X；
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样品信息：用户保密
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实验部分（仪器、试剂与材料）
1
主要仪器设备
UltiMate 3000 with Q-Exactive Plus Orbitrap (Thermo Scientific, Bremen, Germany)
Exion with 6500 QTRAP (Sciex, Framingham, U.S.A)
2
试剂材料
甲醇、乙腈、甲酸为质谱纯；氨水为分析纯；
Strata-X; 20 x 2.0 mm, 25 μm；
3
样品预处理
Protein G板，板的每个孔都用 200 μL PBS(1X) 洗涤两次，正压或负压去除 PBS。将 20 μL 血浆（标准品、质量控制、患者样品）与 80 μL 含有 SIL-NIVO 样（最终浓度 20 μg/mL）的 PBS (1X) 混合，并将混合物分布在板上。然后将板置于室温下的定轨振荡器上。孵育 1 小时后，用 200 μL PBS (1X) 洗涤树脂 3 次。
4
样品净化
LC-MS/HRMS通过使用两次 150 μL 洗脱缓冲液（水/乙腈，50/50，v/v，含 0.1% FA）进行洗脱，然后进行离心步骤（1000g，1 分钟）。将两个部分合并，然后在温和的氮气流下在室温下干燥。残留物用 45 μL 碳酸氢铵 (100 mM) 重悬，洗脱的 IgG 在 37°C 下用 2 μg 胰蛋白酶金消化 16 小时。加入 FA（终浓度为 1%）停止反应后，将样品离心（5 分钟，13 000 g），将 20 μL 澄清的上清液注入色谱装置。
LC-MS/MS用于洗脱的缓冲液是水和乙腈的混合物（70/30，v/v，含 0.5% FA），在快速真空蒸发之前，先用 200 μL 进行两步洗脱。用30 μL 胰蛋白酶消化液再悬浮。在 37°C 下过夜消化蛋白质。然后，将 20 μL 提取的样品注入 LC-MS。
5
LC-MS/HRMS色谱条件
色谱柱：在线样品净化柱(Strata-X; 20 x 2.0 mm, 25 μm)
Luna Omega PS-C18 (100 × 2.1 mm, 1.6 μm)；
泵1：流动相0.1% FA水：0.1% FA乙腈 (95/5; v/v)
泵2：流动相A：0.1%甲酸水溶液；
流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液；
流速：150 μL/min；
柱温：30 ℃
进样量：20 µL
流动相梯度：见表1
表1.流动相梯度表
时间 (min)
A%B%09558901091090
9.1
955129556
LC-MS/MS色谱条件
流动相A：0.1%甲酸水溶液；
流动相B：0.1%甲酸甲醇溶液；
色谱柱：Biozen XB-C18 (100 × 2.1 mm, 2.6 μm)；
流速：100 μL/min；
柱温：40 ℃
进样量：3 µL
流动相梯度：见表2
表2.流动相梯度表
时间 (min)
A%B%0
100
0
1.5
100
056535150
100
1900
19.1
100
029
100
0＋
实验结果
结论：
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对于LC-MS/HRMS和 LC-MS/MS，测定分别在 5–100 μg/mL 和 5–150 μg/mL 范围内显示出良好的线性。LC-MS/HRMS 和 LC-MS/MS 的定量限分别设定为 2 和 5 μg/mL。两种方法也获得了可接受的准确度（从 - 13.6% 到 3.0%）和精密度（20% 以内）值。
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本文部分摘自：《Talanta》Quantification of nivolumab in human plasma by LC-MS/HRMS and LC-MS/MS, comparison with ELISA
https://doi.org/10.1016/j.talanta.2020.121889
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