Nat Biotechnol前沿 | Matthias Mann团队发表空间蛋白组成果，让肿瘤细胞做精细“体检”

精准医学与蛋白组学

2022.5.23

作者景杰生物

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景杰生物 | 报道

解析蛋白的时空特异性，是了解疾病中细胞异质性的关键内容。单细胞蛋白组技术的兴起，尤其是结合显微成像和质谱技术的空间蛋白质组学 (spatial proteomics)，使得对组织异质性的分析手段越来越丰富。

近日，蛋白质组学领域大咖，德国马普所Matthias Mann团队联合多家科研院所，在国际生物技术权威期刊Nature Biotechnology (IF=54.91)上发表了题为Deep Visual Proteomics defines single-cell identity and heterogeneity 的文章。该文章报道了一种融合了人工智能驱动的细胞表型图像分析，与自动化单细胞分选或激光显微切割，和超高灵敏度质谱技术的空间蛋白质组学方法，称之为深度可视蛋白质组学 (Deep Visual Proteomics，DVP)。并将其首次运用于临床肿瘤研究当中，从亚细胞维度和空间维度揭示了肿瘤异质性，为对疾病的认识，及诊治新策略的开发，提供了前所未有的洞察。

技术流程

1）使用显微成像，生成肿瘤患者的临床FFPE组织样本的高分辨率图谱。

2）运用机器学习与人工智能 (AI) 方法，辅助实现细胞的分群与分类。

3）通过高精度激光捕获显微切割，收集对正常或不同类型的病变细胞分群。

4）使用超高灵敏度质谱 (MS) 仪器，在极微量的样本中检测到数千种蛋白。

5）生物信息学分析生成具有空间分辨率的蛋白质图谱。

图1 DVP概念和工作流程

研究结果

一、激光显微切割获取“精细化”的细胞分群

空间蛋白质组学分析的难点之一在于获取精细化的细胞分群。针对这一难题，研究团队开发了一个用于综合图像分析的软件套件，称为“BIAS”。运用深度学习 (DL)、和机器学习 (ML) 算法的表型分类，可实现高特异性的分割感兴趣的细胞区室，避免混入其他细胞或细胞外基质干扰质谱检测结果(图2a)。BIAS与显微镜通过接口链接 (图2b)，传输细胞轮廓，提高切割的准确度。优化后，LMD准确度可达到200nm，精准切割每个样本50到100个细胞。

图2 使用BIAS对正常细胞和癌细胞和组织进行AI驱动的细胞核和细胞质分割

二、DVP 定义亚细胞水平的单细胞异质性

研究者首先将DVP工作流程应用于癌细胞系，在亚细胞水平上定义单细胞异质性。通过基于DL算法的细胞核和细胞膜检测分割，每个表型分离到80-100个单细胞及250-300个细胞核 (图3a)。运用基于timsTOF Pro质谱的全新一代4D蛋白质组学方法进行分析。主成分分析，显示细胞和细胞核蛋白质组显示出高定量再现性 (r = 0.96)，并且全细胞的蛋白质组与单独细胞核的蛋白质组不同。富集分析中，质膜、线粒体、核小体和转录因子复合物等条目非常显著 (图3h)。除此之外，全细胞的单细胞蛋白质组发现了几种以往未被表征的蛋白，并对其潜在的细胞功能进行了注释。以上结果表明，DVP技术可无偏见 (unbiased way) 地将细胞表型、异质性和动力学与蛋白质组水平相关联。

图3 DVP定义了亚细胞水平的单细胞异质性

三、DVP方法定义空间特征的癌组织异质性

研究者随后将DVP方法用于唾液腺腺泡细胞癌、黑色素瘤的临床FFPE组织样本，解释了肿瘤组织的空间异质性。运用DVP方法对唾液腺腺泡细胞癌样本中的正常组织和癌组织进行分类并进行了蛋白质组学分析。正常的组织主要由腺泡、导管和肌上皮细胞组成 (图4b上Ⅰ/Ⅱ)，而癌成分主要具有均匀的肿瘤细胞，具有圆形细胞核和丰富的嗜碱性细胞质 (图4b下Ⅲ/Ⅳ)。正常细胞和癌细胞的较低相关性，反映了蛋白质组的疾病特异性和细胞类型特异性的变化 (r=0.8)。癌中的腺泡细胞标志物显著下调，干扰素反应蛋白和原癌基因SRC的上调，与之前的报道一致[1]，表明了DVP结果的可靠性。

图4 DVP应用于罕见唾液腺癌的FFPE组织

解码黑色素瘤发展中的分子变化，是确定这种高度转移性疾病的治疗策略的关键。研究者进一步研究了黑色素瘤进展的不同细胞表型的空间分辨蛋白质组。用两种标记物SOX10和CD146共同染色原发性肿瘤FFPE样本。由于CD146的过表达与黑色素瘤进展有关，分析中使用CD146 为疾病进展标志物，结合机器学习ML预测了五个具有明确空间分布的细胞群类别：1 类，原位黑色素瘤；2 类，主要是肿瘤；3类，肿瘤微环境细胞；4 类，富含CD146区域；和 5 类，CD146低区域。空间维度上，具有相同特征的区域的直接比较，进一步突出了癌症转移的关键特征。

图5 DVP 应用于原发性黑色素瘤组织

综上所述，该研究使用人工智能结合的激光显微切割捕获技术，从样本中精细收集“目标细胞群”进行蛋白组学分析，能区别具有特异性表型的细胞，并借助蛋白组学分析该细胞的潜在功能。在临床样本研究中，以唾液腺癌组织切片样本为模型，精确选取癌细胞和正常组织细胞，获得更准确的蛋白质组数据。在黑色素瘤组织中，该方法精确分析出，仅在肿瘤区域中出现的与免疫调控和DNA复制相关的特征性蛋白。

以上研究结果表明，DVP在空间上解析肿瘤异质性，提供了绝佳的蛋白分子分析能力，是临床研究中更详细地了解健康和疾病机制的强大武器。

作者点评

本文通讯作者，来自于德国马普所的Matthias Mann 教授说：“当我们的细胞内出现问题并且我们生病时，可以确定蛋白质以多种不同的方式参与其中。因此，绘制蛋白质图谱可以帮助我们确定肿瘤为何会发展在特定患者中，肿瘤有哪些脆弱性，以及哪种治疗策略可能被证明是最有益的。通过结合显微镜、人工智能和超灵敏的基于 MS 的蛋白质组学的力量，我们开发了一种非常强大的方法，可以非常有效地了解健康细胞与疾病细胞的分子连接。这可以帮助医生确定未来药物和诊断的目标。”

本文一作及通讯作者，来自于哥本哈根大学健康与医学科学学院的Andreas Mund 说：“我们的新概念——深度可视蛋白质组学，可能会改变医院分子病理学的游戏规则。通过这种方法，我们可以采集带有肿瘤细胞的组织样本，并且可以在一分钟的时间和精力中识别和确定数千种蛋白质。这些蛋白质组学特征揭示了驱动肿瘤发展的机制，并直接从癌症患者活检的单个组织切片中暴露出新的治疗靶点。它暴露了这些癌细胞内部的大量分子。”

新西兰大学医院病理学系副教授 Lise Mette Rahbek Gjerdrum 说：“这种独特的方法将组织结构与数千种特定于选定细胞的蛋白质的表达相结合。它使研究人员能够研究癌细胞与其周围细胞之间的相互作用，这对未来的临床癌症治疗具有重大意义。最近，我们使用深度可视蛋白质组学诊断出一个高度复杂的临床病例。“

本文的共同一作Fabian Coscia 博士说：“该技术可用于以类似的细节表征所有其他肿瘤类型，使用深度可视蛋白质组学可以更好地理解癌症。该方法也可应用于其他疾病，例如，可以分析神经细胞中的蛋白质，以准确了解阿尔茨海默氏症或帕金森氏症等神经退行性疾病的细胞中发生的情况”。

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