景杰学术 | 报道
磷酸化修饰是最经典的蛋白质翻译后修饰类型之一[1]，ATP/GTP中的磷酸基团在系列磷酸激酶（kinase）及磷酸酯酶（phosphatases）的催化作用下转移到底物蛋白质中诸多氨基酸残基，控制关键信号蛋白质及通路功能。作为细胞内关键的促炎因子，肿瘤坏死因子（TNF）发挥促炎作用的分子机制主要就是通过激活下游相应磷酸激酶，继而影响蛋白质磷酸化修饰[2]。然而，由于磷酸化修饰调控的复杂性[3]，TNF下游分子机制至今仍未全面揭示，这也使得临床运用TNF抗体虽然可以在许多疾病中起到抗炎作用，但许多严重副作用产生的原因却仍不明确。
近日，Max Plank研究所Matthias Mann教授团队，在Nature Communications (IF=14.9)上发表题为 Phosphoproteome profiling uncovers a key role for CDKs in TNF signaling[4] 的研究文章，他们结合高灵敏度的磷酸化肽段富集方法和最先进的质谱仪器，在体外细胞系中系统地分析了TNF调控的磷酸化蛋白质，相关信号通路蛋白质及其磷酸化位点信息。该研究为抗炎药物作用提供了有效信息以及新的潜在药物干预靶点。
TNF相关蛋白质磷酸化修饰的时序分析
研究人员在TNF处理不同时间点（15s~1h）的U937细胞中，共鉴定到28,000个高可信度的磷酸化修饰位点，其中，在TNF处理3分钟后大多数位点磷酸化修饰水平开始出现明显升高趋势，并在15分钟升高至峰值，而多数磷酸化修饰位点1小时后又恢复至基础水平，这些出现瞬时变化的多为NF-κB、Toll样受体和模式识别受体等信号通路相关蛋白质；而少部分转录相关蛋白质的磷酸化修饰水平则在TNF刺激1小时后仍处于上调状态。
图 TNF相关磷酸化蛋白质组学检测结果
TNF刺激下的磷酸激酶-底物关系
TAK1在激活NF-κB、MAPK信号通路中起着至关重要的上游作用，的确，TAK1特异性抑制剂几乎完全阻断了TNF引起的蛋白质磷酸化修饰变化，相反，下游激酶如IKK1/2、p38、MEK1/2和JNK则未能完全抑制TNF相关磷酸化修饰，这也在一定程度上证明了相关蛋白质在信号通路中的上下游关系。随后，在STING蛋白质相互作用网络中，研究人员详尽描绘了多种磷酸激酶与底物的关系。有趣的是，TNF上调的部分蛋白质（如TNIP1、TBKBP1、ATG9A）的磷酸化修饰水平却没有被TAK1抑制剂所抑制，反而被下游IKK1/2激酶抑制剂所抑制，这也提示IKK1/2肯定发挥了一些独立于TAK1活性的功能。与此同时，本次研究也首次发现了一些过去尚未报道的蛋白质磷酸化位点，如HOIL1（T136和S359）。
图 TNF相关磷酸激酶-底物关系
TNF相关磷酸化致使蛋白质重定位
TNF介导的蛋白质磷酸化反应往往依赖于相关激酶、磷酸酯酶的正确定位，并且会导致底物蛋白质发生细胞内重定位。为了系统研究TNF对蛋白质胞内重定位的影响以及磷酸化修饰在此过程中的功能，研究人员分别在添加或不添加TAK1抑制剂的情况下，给予细胞TNF刺激15分钟，随后将细胞的膜、质、核三者分离，进行磷酸化修饰组学分析。数据显示， TNF除了引起TNF复合体相关蛋白质等其他蛋白质的膜易位，并且触发了许多转录相关蛋白质的核易位，以及大多数蛋白质向细胞质的转进或转出过程，而TAK1抑制剂则能在一定程度上阻碍这些蛋白质的重定位过程。
图 TNF相关磷酸激酶-底物关系
TNF靶基因的转录依赖CDK激酶活性
TNF主要通过对多个靶基因进行转录调控来发挥功能，而细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）则能通过调节RNA聚合酶II活性来调节转录过程。蛋白质组学数据显示，广谱CDK抑制剂（Dinaciclib）以及CDK12特异性抑制剂（CDK12-IN3和THZ531）几乎完全逆转了TNF刺激引起的相关靶基因表达，并且也抑制了TNF介导的CCL2和CXCL10 mRNA含量上调效应，验证了CDK抑制剂确实在转录水平上抑制靶基因的表达。
图 CDK抑制剂有效降低TNF靶基因转录
综上所述，此项研究首次在细胞系中利用高深度磷酸化蛋白质组学技术，为广大科研工作者提供了TNF信号相关蛋白质磷酸化修饰位点最全面的动态变化、激酶-底物关系以及蛋白质亚细胞定位等宝贵科学信息，并且发现了诸多影响TNF靶基因表达的关键信号分子，这些都为未来实现TNF生物学功能的精准调控奠定了理论基础。
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参考文献
1. Di Zhang, et al.,2019. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature.
2. Mohideen, F. et al. 2017. Quantitative Phospho-proteomic Analysis of TNFalpha/NFkappaB Signaling Reveals a Role for RIPK1 Phosphorylation in Suppressing Necrotic Cell Death. Mol Cell Proteom.
3. Hideo Hagihara, et al. 2021. Protein lactylation induced by neural excitation. Cell Reports.
4. Maria C. Tanzer, et al. 2021. Phosphoproteome profiling uncovers a key role for CDKs in TNF signaling. Nature Communications.
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