真菌毒素检测
Mycotoxin detection
01
建立了玉米的一步法提取6类真菌毒素同时检测的分析方法。
建立了玉米的一步法提取6类真菌毒素同时检测的分析方法,共分析了96份玉米中6类真菌毒素的污染情况,为监测饲料质量提供技术指导。称取的样品添加6类真菌毒素同位素内标,以84%乙腈水和50%甲醇水作为提取试剂,以2mM乙酸铵0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水为流动相梯度洗脱,采用液相色谱-串联质谱进行检测。94份玉米中6类真菌毒素的检出率为98%,单种毒素检出率最高的是伏马毒素B1和B2,高达88%,呕吐毒素和赭曲霉毒素A检出率最低,均未检出。伏马毒素B1和B2、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的最高残留量分别是89.1mg/kg、76.4ug/kg、3.95×103mg/kg和7.0mg/kg。建立的6类真菌毒素检测方法操作简单、结果准确,结果分析对玉米中真菌毒素污染检测和防控具有重要意义。
02
采用94份玉米为样本,对这6类真菌毒素进行检测方法开发。
真菌毒素属于真菌的代谢产物,几乎可以污染所有的农作物,会损害动物体的肝脏、肾脏及皮肤组织等,进而通过食物链的形式影响到人体的健康。已知的真菌毒素多达300种以上,目前多个国家均建立了饲料中真菌毒素的限量要求,我国已于2017年推出国家强制性标准GB 13078-2017饲料卫生标准,并于2018年实施,其对黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1和B2、T-2毒素等做出明确的检测方法规定和限量要求。本文采用94份玉米为样本,对这6类真菌毒素进行检测方法开发和污染情况分析。为多毒素的快速检测提供技术支持的同时,也为饲料中真菌毒素污染的监测和防控提供帮助。本文采用液相色谱-串联质谱,通过加入同位素内标进行校正的手段,开发6类真菌毒素的检测方法,并对94份玉米样品进行6类真菌毒素的检测及污染情况分析。
关键词
真菌毒素、液相色谱-串联质谱、真菌毒素同位素内标
1.材料
Pribolab普瑞邦生物
1.1
仪器
TSQ Quantis液相色谱-串联质谱、KS-7200DE超声波提取仪和TGL-16M高速冷冻离心机
1.2
试剂
真菌毒素标准品:
黄曲霉毒素B1(货号:STD#1052)、呕吐毒素(货号:STD#3102)、玉米赤霉烯酮(货号:STD#4012)、赭曲霉毒素A(货号:STD#5012)、伏马毒素B1和B2(货号:STD#2013)和T-2毒素(货号:STD#3111)
真菌毒素同位素内标:
黄曲霉毒素B1同位素内标(货号:STD#1041U)、呕吐毒素同位素内标(货号:STD#3101U)、玉米赤霉烯酮同位素内标(货号:STD#4010U)、赭曲霉毒素A同位素内标(货号:STD#5010U)、伏马毒素B1同位素内标(货号:STD#2030U)、伏马毒素B2同位素内标(货号:STD#2040U)和T-2毒素同位素内标(货号:STD#3110U)
1.3
样品
96份玉米(样品来源于全国近30个省份及地区)
依据我国区域划分方式将94份玉米的分布区域进行汇总统计
区域省份份数
华东地区
山东、江苏、安徽、浙江、福建、上海
22
华南地区
广东、广西、海南
10
华中地区
湖南、湖北、河南、江西
12
华北地区
北京、天津、河北、山西、内蒙古
17
西南地区
四川、云南、西藏、重庆
12
西北地区
宁夏、新疆、青海、陕西、甘肃
10
东北地区
黑龙江、吉林、辽宁
11
2.方法
Pribolab普瑞邦生物
2.1
色谱及质谱条件:
色谱柱:Hypersil GOLD C18 (100*2.1 3um)
流动相:2mM乙酸铵0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脱伏马毒素B1和B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和T-2毒素/乙腈水梯度洗脱呕吐毒素和玉米赤霉烯酮
梯度表1
时间
流速mL/min
2mM乙酸铵0.1%甲酸水
甲醇0
0.3
70301
0.3
7030
3.5
0.3
30704
0.3
30705
0.3
5959
0.3
59510
0.3
7030
梯度表2
时间
流速mL/min
水乙腈0
0.3
70301
0.3
7030
3.5
0.3
30704
0.3
30705
0.3
5959
0.3
59510
0.3
7030
采用ESI离子源,分别用正离子模式扫描和负离子模式扫描,多反应监测模式(MRM)采集数据,6类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数见下表:
6类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数
注:FB1为伏马毒素B1简写(下同),FB2为伏马毒素B2简写,AFB1为黄曲霉毒素B1简写,OTA为赭曲霉毒素A简写,T-2位T-2毒素简写,DON为呕吐毒素简写,ZON为玉米赤霉烯酮简写;13C为其相应的同位素内标简写。
2.2
标准品的配置
2.2.1混合标准品配制:配制伏马毒素B1和B2浓度为2.4ppm、黄曲霉毒素B1浓度为80ppb、玉米赤霉烯酮1.6ppm、呕吐毒素3.2ppm、T-2毒素1.6ppm、OTA160ppb的混标。
2.2.2同位素内标配制:配制伏马毒素B1和B2浓度为240ppb、黄曲霉毒素B1浓度为8ppb、玉米赤霉烯酮160ppb、呕吐毒素320ppb、T-2毒素160ppb、OTA16ppb的同位素内标混合标准品。
2.3
样品处理
称取5g样品各两份,加入同位素内标100uL,其中一份加入20mL84%乙腈水,另一份加入20mL50%甲醇水,超声波震荡提取20min,6000r/min离心5min,上清液过0.22um有机滤膜,液相色谱-串联质谱检测。
3.结果分析
Pribolab普瑞邦生物
3.1
谱图
FB1、FB2、AFB1、OTA和T-2的外标及同位素内标的MRM图:
DON和ZON的外标及同位素内标的MRM图:
3.2
回收率
项目
FB1
FB2
AFB1
ZON
DON
T-2
OTA
添加水平
600ng/g
600ng/g
20ng/g
400ng/g
800ng/g
400ng/g
40ng/g
回收率
83.6%
80.4%
101.8%
109.8%
88.0%
91.3%
86.9%
3.3
线性项目
相关系数
线性范围/ng
线性方程
FB1
0.9991
0.19-100
y = 219.68x - 1206.9
FB2
0.9996
0.19-100
y = 911.45x - 1989.7
AFB1
0.9993
0.049-40
y = 61482x + 6.8125
ZON
0.9995
0.094-35
y = 8008.3x - 42517
DON
0.9999
2-450
y = 2755.5x - 796.14
T-2
0.9994
0.1-100
y = 110254x - 63112
OTA
0.9997
0.01-20
y = 1824.1x + 1.5954
3.4
整体污染情况
对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总,所有样品均未检出赭曲霉毒素和T-2毒素。96份玉米中有2份玉米不含有这6类真菌毒素,10份玉米只含有1类真菌毒素,32份玉米含有2类真菌毒素,44份玉米含有3类真菌毒素,6份玉米含有4类真菌毒素。
污染情况占比图
3.5
区域分布情况
依据94份样品分布区域进行划分,对6种真菌毒素进行分析汇总(汇总表见下),西北地区玉米受真菌毒素污染的种类最少,污染程度最低;华中地区、华北地区、西南地区和东北地区毒素污染情况较重;华东地区和华南地区玉米受真菌毒素污染的种类和程度最高。
3.6
超限情况
3.6.1对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总,依据GB 13078-2017 饲料卫生标准限量要求进行超限判断(表1),超限样品共计14份,其中9份样品一类真菌毒素超限,剩余5份样品两类真菌毒素超限。针对赭曲霉毒素和T-2毒素含量,所有样品均合格;此外,其余样品超限情况如下:伏马毒素B1+B2、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为:3份、2份、11份和3份,其对应的超限率分别为3.2%、2.1%、11.7%和3.2%。
表1 部分饲料原料中6类真菌毒素检测标准及限量要求
项目
产品名称
检测标准
限量
黄曲霉毒素B1
玉米加工产品、花生饼(粕)
NY/T 2071
≤50ug/kg
赭曲霉毒素A
谷物及其加工产品
GB/T 30957
≤100ug/kg
玉米赤霉烯酮
玉米及其加工产品
NY/T 2071
≤0.5mg/kg
呕吐毒素
植物性饲料原料
GB/T 30956
≤5mg/kg
T-2毒素
植物性饲料原料
NY/T 2071
≤0.5mg/kg
伏马毒素B1+2
玉米及其加工产品
NY/T 1970
≤60mg/kg
3.6.2对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总,依据GB 2761-2017 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量要求进行超限判断(表2),超限样品共计46份,其中25份样品一类真菌毒素超限,剩余21份样品两类真菌毒素超限。针对赭曲霉毒素含量,所有样品均合格;此外,其余毒素超限情况如下:黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为:4份、35份和28份,其对应的超限率分别为4.3%、37.2%和29.8%。
表2 部分食品中6类真菌毒素检测标准及限量要求
项目
食品类别
检验方法
限量
黄曲霉毒素B1
玉米、玉米面及玉米制品
GB 5009.22
20ug/kg
赭曲霉毒素A
谷物及其制品
GB 5009.96
5.0ug/kg
玉米赤霉烯酮
玉米、玉米面(渣、片)
GB 5009.209
60ug/kg
呕吐毒素
玉米、玉米面(渣、片)
GB 5009.111
1000ug/kg
3.7
单类毒素分析
由于所有样品均未检出赭曲霉毒素和T-2毒素,故只对其余四类真菌毒素进行单独分析。
94份玉米中6类毒素污染情况对比图
3.7.1 伏马毒素B1+B2
对96份玉米的伏马毒素B1和B2检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为88份,占比93.6%,检测结果在0.0503mg/kg-89.1mg/kg,中位值为6.41mg/kg;整体污染水平为10.9mg/kg,阳性污染水平为11.6mg/kg。
3.7.2 黄曲霉毒素B1
对96份玉米的黄曲霉毒素B1检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为29份,占比30.9%,检测结果在2.20ug/kg-76.4ug/kg,中位值为4.58ug/kg;整体污染水平为3.48ug/kg,阳性污染水平为11.3ug/kg。
3.7.3 玉米赤霉烯酮
对96份玉米的玉米赤霉烯酮检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为56份,占比59.6%,检测结果在10.6mg/kg-3.95×103mg/kg,中位值为98.3mg/kg;整体污染水平为329mg/kg,阳性污染水平为552mg/kg。
3.7.4 呕吐毒素
对96份玉米的呕吐毒素检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为56份,占比59.6%,检测结果在0.1mg/kg-7.0mg/kg,中位值为1.0mg/kg;整体污染水平为0.8mg/kg,阳性污染水平为1.4mg/kg。
4.讨论
Pribolab普瑞邦生物
4.1
保证饲料产品质量
目前,从技术角度讲,饲料中真菌毒素检测共涉及到6大类,检测标准4项,前处理方法不一,净化产品各异,对人员、操作、设备要求苛刻,给检测带来严峻的挑战;从污染根源分析,一种真菌可能产生多种毒素,一种原料会受到多种真菌感染,往往是单个饲料样品需要检测多种真菌毒素;从现实情况来看,饲料受真菌毒素污染情况较严重,且分布不均匀,需要加强其毒素监测。本文所述的一步法检测,采用直提的方式,同位素校正的手段,在保证结果准确的前提下,最大程度降低操作难度,缩短检测周期,同时也控制了实验成本。
综上,本文不仅为饲料中6类真菌毒素的检测提供有效的方法支撑,同时也为饲料中真菌毒素残留的检测方向提供指导,为保证饲料产品的质量提供帮助。
普瑞邦生物
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