酒精相关肝病（ALD）是常见的慢性肝病，经常导致肝硬化；随着发病率上升，已成为肝移植的主要适应症。ALD从酒精相关脂肪肝开始，到以肝脏炎症为特征的亚临床脂肪肝性肝炎，进而出现进行性纤维化，最终导致肝硬化。目前将近75%的ALD患者在发生失代偿期肝硬化后才被诊断，导致错过了最佳治疗阶段。肝病的准确诊断依赖活检，这会导致1%的患者出现严重并发症。而现有的非侵入性生物标志物在疾病早期准确性有限，严重减少了及时发现和干预疾病的机会。
2022年6月，马克斯·普朗克生物化学研究所Matthias Mann团队在Nature medicine（IF 50.768）上发表题为"Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease“的研究文章，作者利用DIA蛋白质组学结合机器学习算法，成功确定了三组生物标志物，可以检测显著纤维化、轻度炎症活动和任何脂肪变性。换言之，该研究标志物可检测任何肝损伤，并帮助预测患者是否具有疾病进展风险，有巨大的临床应用潜力。
研究材料
ALD筛选队列（n=459，均有血液样本，其中79人有肝脏活检组织）；
健康队列（n=137，均有血液样本）；
独立ALD验证队列（n=63，均有血液样本）
技术路线
步骤1：患者入组及基线信息分析；
步骤2： 蛋白组学：分析肝脏病变对肝脏和血浆蛋白质组的影响；
步骤3：数据分析：肝脏和血浆蛋白质组学数据整合；
步骤4： 机器学习：ALD早期病理学生物标志物；
步骤5： 独立队列验证模型性能。
研究结果
1. 患者入组及基线信息分析
本研究人群来自三个队列的参与者：1）肠肝轴-ALD队列（GALA-ALD），n=459，具有随访数据的前瞻性队列（连续招募的具有有害饮酒史的患者，代表疾病早期的无症状ALD）；2）肠肝轴-健康参与者（GALA-HP），n=137。与GALA-ALD相匹配的横断面队列；3）独立ALD验证队列，n=63，来自ALD筛查研究的横断面队列。作者进一步统计了所有受试者的临床特征。
表1 参与者基线特征
2. 蛋白组学：分析肝脏病变对肝脏和血浆蛋白质组的影响
肝脏蛋白质组检测出717种独特差异蛋白（占总量化蛋白的13%）。其中658种蛋白在纤维化阶段，135种蛋白在炎症活动阶段，68种蛋白在脂肪变性阶段发生显著失调。纤维化对肝脏蛋白质组的影响最大、其次是炎症；而炎症过程中失调的所有蛋白质中84%在纤维化中失调。根据人类蛋白质图谱的注释对失调蛋白进行分组，发现随着纤维化的增加，87%注释为肝脏特异性的蛋白在肝组织中下调；相反，80%注释为分泌的蛋白质被上调。在纤维化阶段最相关的前20种蛋白中，主要是肝脏分泌的蛋白（如TGFBI 和 EMILIN1），纤维化相关蛋白（如IGFBP7和 TNXB）。此外，前20种验证相关蛋白中约50%是细胞骨架蛋白，指征了炎症过程中肝脏细胞结构变化。而脂滴蛋白PLIN2和脂肪酸结合蛋白4（FABP4）可作为NAFLD47患者从单纯脂肪变性变向非酒精性脂肪肝炎的预测标志物，与肝脂肪变性相关的系数分别排在第1和第16位。
图1 肝脏病变导致肝脏蛋白质重塑
血浆蛋白质组检测发现，共225种蛋白在纤维化阶段（206种）、炎症活动（163种）和脂肪变性（48种）的组织学阶段发生显著变化。其中，随着纤维化阶段增加，134中蛋白上调、91中下调。在注释为肝脏特异性或分泌的失调蛋白中，分别发现83%和64%被下调。下调的簇包含参与补体系统蛋白、凝血级联反应相关蛋白、载体蛋白和和载体蛋白。相关性分析显示，分别有106种、55种和5种蛋白与纤维化、炎症和脂肪变性相关。其中补体成分C7、QSOX1和LGALS3BP与纤维化程度相关性最高（也是前三个与炎症相关蛋白），具有纤维化和炎症标志物潜力。
图2 肝脏病变重塑了血浆蛋白质组
3. 数据分析：肝脏和血浆蛋白质组学数据整合
肝脏和血浆中总共有420种蛋白质被量化， 他们在二维空间中的水平表现出双模态模式。其中一组蛋白质，肝脏和血浆的相对丰度排名在很大程度上是相关的 （“对角聚类”），而另一组没有相关性（“垂直聚类”）。相关性分析显示，112种蛋白在肝脏和血浆样本之间存在显著关联。肝脏和血浆蛋白质组的协方差分析中找到46种共调控蛋白，功能涉及免疫和炎症反应、细胞粘附、ECM组织、蛋白酶抑制剂和细胞内酶等。
图3 肝脏-血浆蛋白质组整合
4. 机器学习：ALD早期病理学生物标志物
作者比较了22种机器学习分析方法，并确定逻辑回归模型作为最终分类器。作者选定三组标志物分别识别显著纤维化（9种蛋白）、轻度炎症活动（6种蛋白）和任何程度的肝脂肪变性（6种蛋白）。在包含三组标志物的22个蛋白中，有8种在血浆和肝脏中受到协同调节，包括 C7、LGALS3BP、TGFBI、ALDOB、CLEC3B、FBLN1、ATRN 和 SERPINF1。重要的是，这三组标志物对显著纤维化（AUC=0.90，95% CI=0.899–0.905）、轻度炎症（AUC=0.85，95% CI 0.851–0.858）和脂肪变性（AUC=0.91，95% CI 0.907– 0.915）均有很好的诊断效能，且优于现有的15项临床测试模型。
图4 基于血浆蛋白质组的纤维化、炎症和脂肪变性预测模型
5. 独立队列验证模型性能
验证结果显示，在健康对照组（n=136）中，该模型正确排除了显著纤维化、晚期纤维化和轻度炎症，其准确率分别是99%、100%和98% ，约15%的个体被归为脂肪变性阳性，与他们BMI与ALD队列一致相关。此外，在有酒精滥用史且由于肝硬度低而未进行活检的患者子集（n=97）中，该模型排除显著和晚期纤维化的准确率分别是93%和100%。接着，作者在独立的ALD队列（n=63）中进行验证，显著纤维化和轻度炎症的模型效能高于其他同类模型，ROC-AUC分别是0.87和0.81。更重要的是，显著纤维化的蛋白组学模型相比于现有标志物，对患者肝脏相关事件（LRE）具有最高的判别准确率（Harrell''s C = 0.900 ，3年和5年AUC分别是 0.945和0.933）；对于全因死亡率，蛋白组学模型也表现最好（Harrell''s C = 0.789、3 年和 5 年 AUC 分别 = 0.836 和 0.818）。
图5 模型性能验证和预测能力评估
小编小结
作者结合了3个队列（一个前瞻性、一个横断面和一个独立队列），利用DIA蛋白组学技术探究肝脏病理生理相关的肝脏和血浆蛋白组学变化，发现肝脏和血浆蛋白质组在ALD期间都经历了广泛的重塑过程，其中影响最大的是纤维化，其次是炎症和脂肪变性。接着，作者还利用机器学习定义了用于同时检测“显著”纤维化（纤维化阶段 ≥F2）、轻度炎症活动和任何脂肪变性的生物标志物组，并在与现有的测试比较中展现了优于或可比同类比较器的性能。重要的是，结合随访数据进一步证实了蛋白组学模型对于肝脏相关事件和全因死亡率的高预后性能。本研究为酒精性肝病的临床精准防治奠定了基础。
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