BD Rhapsody与FACS整合单细胞解决方案解密CTXᵖʳᵉ/ACT/CD4ᵖᵒˢᵗ细胞治疗机制

吉凯基因

2022.6.15

作者吉凯基因

TA的动态

引言

单细胞RNA测序技术已经被广泛应用于细胞治疗和抗肿瘤等相关研究中，今天为大家分享一篇发表在NATURE COMMUNICATIONS（IF：13）上题为Adoptive immunotherapy with transient anti-CD4 treatment enhances anti-tumor response by increasing IL-18Rαhi CD8+ T cells的高分文章。

背景介绍

过继T细胞疗法(ACT)利用体外的肿瘤反应性T细胞(ex-T细胞)(例如，分选T细胞、TILs和基因工程T细胞)输注到患者体内，直接攻击恶性细胞。这类疗法通常需要淋巴细胞耗尽处理以消除免疫抑制因素，使过继转移的肿瘤反应性 T 细胞有效植入。由于抗 CD4 单克隆抗体会消耗 CD4+ 免疫抑制细胞，因此抗CD4治疗和ACT在癌症治疗中具有协同潜力。

本文作者用肿瘤反应性 CD8+T 细胞输注治疗，设计了CTXpre/ ACT/CD4post的鼠黑色素瘤治疗方案（CTXpre，环磷酰胺预处理；CD4post，抗CD4后调节），对过程机制进行深入研究。

技术亮点

BD Rhapsody™单细胞仪器、试剂盒及分析平台：

BD Rhapsody单细胞分析系统

BD Rhapsody单细胞全转录组分析（WTA Reagent Kit）

BD Rhapsody多样本标签（Mouse immune single-cell multiplexing kit）

BD Rhapsody Seven Bridges Analysis pipeline

BD FACS流式细胞仪及分析软件：

FACSAria、FACSMelody、FACSVerse、LSRFortessa；FlowJo

文章概览和实验设计

主要结论

CTXpre/CD4post增强ACT疗效

作者设计了CTXpre、ex-T细胞和CD4post的协同增加ACT疗效的治疗方案（Fig.1a），相比于CTX/anti-CD4 或 CTX/ex-T 组，联合治疗组CTXpre / CD4post显著增加了肿瘤抑制和ex-T-cell-transferred老鼠的存活率（Fig.1c，n=10 mice/组）。而且在CTXpre / CD4post治疗的小鼠组中出现了白癜风，这暗示CD8+ T细胞诱导黑素细胞的破坏、CD8+ T细胞反应增强 (Fig.1e，n=10 mice/组)，表明联合治疗黑色素瘤具有很强的潜力。

CTXpre/CD4post促进CD8+ T细胞的分化和增殖

上一步暗示CD8+ T细胞活性与抗肿瘤反应密切相关，作者检测了CTXpre/和CTXpre/CD4post的小鼠中CD8+T细胞的增殖和持久性，将体外注入的Thy1.1+ Pmel-1细胞(用黑色素瘤特异诱导的CD8+T细胞，ex-T细胞)和未受刺激CD45.1+ CD8+ T细胞(en-T细胞)标记不同的荧光，转移到种瘤或不种瘤C57BL/6小鼠（Fig.2e），评估在有或没有黑色素瘤的情况下T细胞的增殖情况。

作者发现无论肿瘤是否存在，CTXpre/CD4post都增加Thy1.1+和CD45.1+细胞的数量（Fig.2f, n=4 mice/组），Thy1.1+ Pmel-1细胞大量扩增，大多数迅速分裂并分化为CD44+ CD62L−效应记忆表型，表明ex-T细胞具有增殖优势。

CTXpre/CD4post增加内源性CD8+ T细胞的效应功能和肿瘤反应性

作者用同时分泌多种效应细胞因子的细胞比例，评估en-T细胞的效应功能，发现CTXpre/CD4post的多功能en-T细胞的比例显著高于CTXpre组。

作者检测了黑色素瘤刺激后en-T细胞的CD25表达和杀伤活性。在CTXpre/CD4post组中，en-T细胞中表达CD25的细胞比例明显高于CTXpre组（Fig.3c, n=4 mice/组），提示抗CD4治疗提高了CD8+ T细胞的肿瘤反应性，体外杀伤实验进一步证实CTXpre/CD4post的en-T细胞对黑色素瘤的杀伤效率高于CTXpre的en-T细胞(Fig.3d)。而且CTXpre/CD4post增加了肿瘤内ex-T和en-T细胞的浸润(Fig.3g, n=4 mice/组)。

这些结果表明，在ACT联合模型中，使用抗CD4治疗增加了效应功能、肿瘤反应性和内源性CD8+ T细胞的瘤内浸润。

CTXpre/CD4post治疗富集了IL-18Rαhi CD8+ T细胞

为了进一步确定方案中有助于抗肿瘤反应的因素，作者用微阵列技术研究了en-T细胞(Fig.4a)在CTXpre/CD4post免疫调节环境中的CD8+ T细胞的基因表达谱。发现在CTXpre/CD4post的en-T细胞的Ifng和Il18r1上调，它们编码IL-18—IL-18R信号转导的关键成分。在IL-18Rα表达水平分组的三个群体中，CTXpre/CD4post小鼠中IL-18Rαhi en-T细胞显著富集(Fig.4c, n =5 mice/组)。

利用Bulk RNA测序对IL-18Rαhi en-T细胞进行基因分析，发现在微阵列检测的CTXpre/CD4post中上调的与T细胞增值/分化相关的基因，在IL-18Rαhi en-T细胞中上调了3倍。作者还通过多维蛋白表达分析，将IL-18Rαhi en-T细胞表型特征定义为CD44+ CD62L- CD49d- CXCR3+ T-bet+( Fig.4g)。

IL-18Rαhi CD8+ T细胞抗肿瘤活性增强是通过TCR/IL-18信号通路介导的

作者分选出IL-18Rαhi en-T细胞，转移到Rag1敲除的B16- F10小鼠体内(Fig.5b)，发现结合抗MHC I抗体治疗利于肿瘤治疗（Fig.5c，n=5 mice/组），这意味着是MHC I和TCR的相互作用对肿瘤有抑制作用。作者还通过一系列分析验证了CTXpre/CD4post治疗能诱导一个持续产生IL-18Rαhi CD8+ T细胞的环境，该细胞在应答TCR和IL-18信号通路中发挥强大的效应功能。而且IL- 18Rαhi CD8+ T细胞需要CTXpre、IL-2、CD4post、Treg等多种因素协同诱导。

单细胞测序验证CD4post对CD4+T细胞和Il18r1+亚群的影响

为了更详细地了解不同方案之间的差异，作者对淋巴样细胞进行了单细胞转录组分析，比较了两者的细胞亚群丰度和差异基因表达情况。在细胞亚群组成上，CD4post的添加特异性地影响CD4+ T细胞，而在其他簇中未观察到显著变化（Fig.s9a）。

作者对en-T和ex-T细胞进行单细胞转录组测序分析，以确定CD8+ T细胞在CTXpre/CD4post的基因表达谱。与CTXpre组相比，CTXpre/CD4post组的en-T和ex-T（Fig.6d，n=4 mice cells pooled）细胞高表达Il18r1的亚群中细胞数量更多。和Bulk测序结果一致，这些簇也显示了在IL-18Rαhi富集的en-T细胞中高表达的几个基因的显著表达。高表达Il18r1的亚群也高表达Il7r，表明Il7r信号可以影响IL-18Rαhi细胞的产生（Fig.6f）。

为了证实这一点，在目前的CTXpre/CD4post方案中引入了IL-7-Fc治疗，发现IL-7信号放大显著增加了IL-18Rαhi en-T和ex-T（Fig.6h, n=5mice/组）的数量和比例。

讨论

用ACT治疗B16-F10黑色素瘤的小鼠模型中，CTXpre/CD4post通过加速ex-T和en-T的增殖和分化来提高抗肿瘤疗效，提高了IL-18Rαhi CD8+ T亚群的频率，表现出TCR/IL-18信号依赖的抗肿瘤活性。单细胞转录组分析进一步确认了对CD4+ T细胞和IL-18Rαhi CD8+ T的影响，后续实验表明，IL-7信号的扩增对IL-18Rαhi ex-T和en-T细胞的增加至关重要。

这项研究强调了CD4post 在 ACT 中的临床相关性，提供了关于黑素瘤抗 CD4 治疗的免疫学性质的见解。进一步研究其他肿瘤模型并将其转化，将为制定安全有效的ACT策略提供指导依据。

单细胞多组学平台

BD Rhapsody™

BD Rhapsody™ 单细胞多组学分析系统能够对成千上万个单细胞的蛋白与基因进行数字定量，提供灵活的定制化Panel及标准化应用方案，以满足不同的实验需求，其独特的混样技术可有效节约时间与成本。

系统组成包括：

BD Rhapsody™ 扫描仪

BD Rhapsody™ 上样台

BD Rhapsody™ cartridge（微孔板）

分子标签试剂和文库制备

全转录组检测试剂盒/靶向RNA检测试剂盒/定制试剂盒

Abseq蛋白检测试剂盒

多样本混样检测试剂盒

VDJ检测试剂盒

单细胞测序数据分析软件BD SeqGeq

参考文献：

NATURE COMMUNICATIONS. (2021) 12:5314. https://doi.org/10.1038/s41467-021-25559-7. Adoptive immunotherapy with transient anti-CD4 treatment enhances anti-tumor response by increasing IL-18Rαhi CD8+ T cells.