番茄根结线虫诱导的虫瘿内源多肽和次生代谢产物的质谱成像分析
期刊：Molecular Plant-Microbe Interactions
IF：4.171
单位：法国蔚蓝海岸大学
研究背景
2018年法国蔚蓝海岸大学 Janice de Almeida Engler等人在Molecular Plant-Microbe Interactions上发表了题为“Imaging mass spectrometry of endogenous polypeptides and secondary metabolites from galls induced by root-knot nematodes in tomato roots “的研究论文。该研究揭示了番茄根结线虫诱导的虫瘿内源多肽和次生代谢产物的质谱成像情况。
线虫是一种毁灭性的害虫，会感染大多数栽培植物物种，并在全球范围内造成相当大的农业损失。了解植物与线虫相互作用期间引起的代谢调整对于产生抗性植物或选择更有效的工具来对抗这种害虫至关重要。虫瘿是植物组织遭受昆虫等生物取食或产卵刺激后，细胞加速分裂和异常分化而长成的畸形瘤状物或突起，它们是寄生生物生活的"房子"。已应用免疫细胞化学方法来定位虫瘿和线虫中存在的特定蛋白质。然而，这种技术仍然仅限于少数几种大分子，成本高昂，而且对小分子（如代谢物）的深入了解效率不高。
研究思路
研究结果
1、样品制备-14 DAI的90 µm虫瘿切片更适合进行MALDI-MSI实验
从感染线虫的番茄根中收集不同时间点（14到30 DAI）的虫瘿，用于MALDI-MSI实验的切片（图 1A）。在14 DAI 时，虫瘿仍在发育，在30 DAI时，虫瘿完全分化并停止扩张，尽管在这两个阶段都存在高代谢活动。最初，作者生成厚的切片，范围从50到300μm，在120μm 的厚度时观察到最佳形态（图 1B）。使用立体显微镜在明场下观察切片以评估组织和切片质量。记录图像（图 1B），随后将部分转移到 MALDI靶板上。通过拍摄另一张软件采集的显微照片来监测转移过程中组织保存的成功（图 1C）。在虫瘿组织上观察到的离子分布表明细胞内容物的损失和明显的流动性，表明分子没有正确固定在组织中，使得这种策略不适合MALDI-MSI实验（图 1D）。
为了避免在温和固定和振动切片的虫瘿组织中观察到细胞内容物的扩散和损失问题，将虫瘿嵌入蛋黄、明胶或琼脂糖中，并在 -15°C下进行冷冻切片。尽管这些程序更精细以保持组织完整性，但它们不太容易发生成分扩散。只有用蛋黄制备的样品才能使作者获得厚度低至 10 µm的切片。嵌在明胶或琼脂糖中的虫瘿块在低温下迅速变脆，用于冷冻切片。当蛋黄用作包埋介质时，样品呈现出良好的切片质地。由于低至10 µm的较薄切片会导致较大的巨细胞出现孔洞和细胞质损失，因此将冷冻切片增加到90 µm厚度以解决此问题，避免细胞损伤并且更适合MALDI-MSI的样品制备过程。此外，在14 DAI 和30 DAI切片约30个虫瘿后，第一个时间点显示更容易获得含有巨细胞的完整切片。因此，后续实验选择了14 DAI。
图1：MALDI-MSI应用于线虫诱导的虫瘿中具有高分子量的分子的鉴定。A) 被线虫感染的根系统的图像。B) 接种后14天的虫瘿切片的显微照片。C) 转移到 MALDI板后同一切片的图像。D) 在虫瘿组织上识别的离子分布。
2、虫瘿高分子量离子的MALDI-在虫瘿中发现10个具有不同m/z值的离子，并且与未侵染的根相比质谱图存在明显差异
在显微镜观察之后，将完整的虫瘿切片进行基质沉积，并进行高分子量离子 (HMWI) 的 MALDI-MSI。所有测试的基质都促进了不同强度水平的分子电离，但芥子酸被证明在所分析的m/z范围内更有效。因此，它被用来研究线虫侵染部位的肽和蛋白质（图2A和2B）。10个具有不同m/z值（3,000 到 11,000）的分辨良好的离子被映射到发育中的虫瘿中（图2C到2L）。对从不同植物获得的虫瘿的分析表明，质谱呈现出类似的电离和离子分布模式。未感染根的HMWI的MALDI-MSI生成的质谱与从虫瘿获得的质谱明显不同，并且与虫瘿相比，在未感染的根中检测到更多的离子。
图 2. MALDI-MSI应用于描绘线虫诱导的虫瘿中具有高分子量的分子。A) 显微照片显示接种后14天的虫瘿冷冻切片，其中含有完整的巨细胞。B) 得到的整体质谱图。C到L) 识别的不同离子的空间定位。
3、虫瘿低分子量离子的MALDI-MSI-虫瘿和未侵染的根存在巨大差异，鉴定出的18个低分子量离子都是脂质类物质
在显微镜观察后，分别将有和没有基质沉积的完整切片进行低分子量离子（LMWI）的 MALDI-MSI。对14 DAI冷冻切片（图 3A）进行的无基质沉积分析中获得的光谱显示存在具有不同强度值的离子，获得大约44个m/z 值范围为104.18至923.83的分子（图 3）。关于虫瘿中低分子量分子的空间位置（图 3C），一些离子位于维管细胞和巨型细胞附近的细胞中（图 3D）或最有可能位于表皮细胞中（图 3E），而其它离子则广泛存在于所有细胞中类型，包括巨型细胞（图 3F）。
未受感染的根和虫瘿14 DAI的MALDI-MSI采集产生的质谱具有不同的离子谱（图 4A-B 为未感染的根，4M-N为虫瘿）。作者的研究结果表明，一些仅限于表皮细胞的离子在未感染的根细胞（图 4C）和虫瘿（图 4O）中分布相似。其它离子位于未感染根（图 4D和G）和虫瘿（图 4P和S）的表皮和维管细胞中。
同样，某些离子仅存在于维管组织中（图4E为未感染的根，图4Q为虫瘿）。然而，特定离子在未受感染的根（图 4F）中的分布比在受感染的根（图 4R）中的分布要多。虽然作者没有检测到仅存在于虫瘿中的离子，但主要存在于表皮细胞中的某些离子仅存在于未感染的根中（图4H-L和4T-Z）。
为了预测MALDI-MSI实验中检测到的LMWI相关的结构，经过文献和代谢数据库Lipid Maps的研究，根据m/z、同位素分布模式和组织定位的生物学意义对所获得的光谱进行了细致的分析。因此，作者提出了18个LMWI的结构，除了两个脂肪酰基和两个天然带正电荷的分子：胆碱和磷酸胆碱外，几乎所有离子都被表征为甘油磷脂 (GPL) 脂质分子。
在2,5-DHB基质沉积后通过升华对两个不同的未感染根和虫瘿14 DAI的切片进行的 MALDI-MSI分析揭示了大约36个具有相似分布模式的离子。唯一的例外是离子m/z 235.2，它仅在虫瘿中观察到。
图 3. MALDI-MSI应用于描绘线虫诱导的虫瘿中具有低分子量的化合物。A) 受侵染根的离子的整体质谱图。B) m/z 736.40和738.41处离子的同位素分布。C) 接种后14天含有巨细胞的虫瘿冻切片的显微照片。D) 位于血管组织、巨细胞和邻近细胞中的离子。E) 位于表皮细胞中的离子。F) 位于表皮细胞、血管组织、巨细胞和邻近细胞中的离子。
图 4. MALDI-MSI用于描绘未感染根（A到L）和线虫诱导的瘿中（M到Z）具有低分子量的化合物。A和M) 获得的全局质谱图。B和N) 进行MALDI-MSI分析的根和虫瘿切片的显微照片。未感染的根 (C到L)和虫瘿(O到Z) 中确定的不同离子的空间位置。
4、脂质提取和鉴定-对MALDI-MSI鉴定结果进一步通过MALDI-TOF-MS/MS和ESI-Q-TOF进行验证，并确定了两个离子的分子式为C44H80NO8P和C42H80NO8P
为了确认在MALDI-MSI实验中鉴定的LMWI是否具有被电离为锂加合物的脂质性质，并为预测的结构提供更多的信心，对未感染的根进行了脂质提取。通过MALDI-TOF-MS以正离子模式分析脂质提取物，并在LIFT模式 (MS/MS) 中进行离子碎裂。从未感染根的MALDI-MSI实验（图 5A）和脂质提取物（图 5B）获得的光谱具有相似同位素分布的分子，这些分子被电离为锂加合物，尽管总体上它们略有不同。加合物 [M+7Li]+ = 788.6被选为 MS/MS实验的前体离子，结果光谱的分析（图 5C）显示是与甘油磷酸胆碱 (GPC)碎片相对应的离子。这类分子由甘油构成，其中两条脂肪酸 (FA) 链以酯的形式连接到sn-1和sn-2碳位置。在这里，FA链被设计为具18个碳原子和两个不饱和度 (18:2/18:2)。在sn-3碳处，磷酸以相同的方式连接，带正电的季铵与磷酸盐结合（图 5C）。除了磷酸胆碱外，作者还对来自未感染根提取物的其它GPC进行了表征。
通过高分辨率质谱分析脂质提取物，旨在确定进行MALDI-TOF-MS/MS实验的加合物的准确质量，并通过确定质量准确度来证实光谱解释。通过MALDI实验破碎的两个加合物也被 ESI-Q-TOF电离（[M+7Li]+ = 788.5780和[M+7Li]+ = 764.5781）。与这些离子相关的结构的分子式为 C44H80NO8P和C42H80NO8P，质量精度分别为 0.2和0.1 ppm。
图 5. MALDI-TOF MS/MS对未感染番茄根的甘油磷脂 (GPC) 进行表征。未感染根的MALDI-MSI(A) 和未感染根脂质提取物的MALDI-MS的质谱(B) 在相同质量范围内显示m/z 788.6处的离子。(C) 母离子[M+7Li]+ = 788.6 的MS/MS谱图，显示与GPC (18:2/18:2) 碎裂相对应的所有碎片离子。
5、蛋白质提取和鉴定-为了对MALDI-MSI鉴定的HMWI进行研究，进一步通过MALDI-TOF-MS进行蛋白质鉴定
为了测试通过MALDI-MSI在虫瘿中鉴定的HMWI是否进行后续研究，进行了蛋白质提取。将虫瘿研磨并使用Milli-Q H2O/乙腈溶液进行肽/蛋白质提取。将溶液离心并通过UFLC对上清液进行分级（图 6）。收集色谱馏分并通过MALDI-TOF-MS以线性正离子采集模式进行分析。表1显示了在分析的所有色谱馏分中鉴定的离子的m/z值。
表 1. 对从14 DAI虫瘿提取物获得的色谱馏分进行线性MALDI-TOF-MS确定的平均质量值。与MALDI-MSI实验中确定的值匹配的离子标记为灰色。
全文总结
基质辅助激光解吸/电离质谱成像 (MALDI-MSI) 已在本文用于原位检测和绘制来自线虫诱导的虫瘿内源性多肽和次级代谢物。该技术的主要关键特征之一是样品制备，主要是生成具有刚性细胞壁和空泡细胞质的植物细胞完整切片。作者的实验设置能够获得没有外源离子污染或分子扩散的切片，并绘制出与线虫诱导的虫瘿相比，未感染根中低分子量和高分子量离子的表达模式。作者预测未感染的根和虫瘿中存在脂质，这已通过MALDI-TOF-MS/MS和脂质提取物的高分辨率质谱分析得到验证。
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