（图片来源：包图网）
疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色谱或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
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对于小分子物质，根据其极性的大小可以分为亲水性分子和疏水性分子，一般来说亲水性的小分子是很难与HIC介质发生作用的。但对于疏水作用色谱的主要对象生物大分子如蛋白质而言，其亲水性或疏水性是相对的，即使是亲水性分子也会有局部疏水的区域，从而可能与HIC介质发生疏水作用，因此能够根据其疏水性的相对强弱不同进行分离。
HIC介质是在特定的基质如琼脂糖上连接疏水配基如烷基或芳香基团组成的。HIC介质与具有疏水性的生物分子间的作用被认为与疏水性分子在水溶液体系中的自发聚集一样，是由熵增和自由能的变化所驱动的。盐类在疏水作用中起着非常重要的作用，高浓度盐的存在能与水分子发生强烈作用，导致可以在疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进了疏水性分子与色谱介质的疏水配基之间发生结合。
因此在HIC过程中，在样品吸附阶段采用高盐浓度的溶液，使得目标分子结合在色谱柱中，而在洗脱阶段，采用降低洗脱剂中盐浓度的方式使溶质与色谱介质间的疏水作用减弱，从而从色谱柱中解吸而被洗脱下来。对于以芳香基团作为疏水配基的色谱介质来说，还存在潜在的发生π-π作用的可能当待分离物质表面具有芳香基时，就会表现出疏水作用和π-π作用的混合分离模式。
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从理论上看，HIC和RPC是两种密切相关的液相色谱技术，它们都是基于生物分子表面的疏水区域与色谱介质上的疏水配基（烷基或芳香基）之间的流水相互作用，然而在分子水平的色谱机理以及实践层面上这两种技术是有所不同的。
RPC介质上疏水配基的取代程度大大高于HIC介质。RPC介质可以认为是连续的疏水相，其配基如C4~C18烷基的取代程度通常在数百微摩/mL凝胶：而HIC介质上配基如C2~C烷基或简单芳香基的取代程度通常在10~50mmol/mL凝胶范围内，可以看作是不连续的疏水相，在与生物分子结合时由一个或数个配基参与。
那么很显然，疏水溶质与RPC介质间的作用力要比HIC介质强得多，需要使用有机溶剂梯度等剧烈的洗脱条件才能将溶质从色谱柱中洗脱下来，对于球状蛋白质，在这样剧烈的洗脱条件下往往会发生变性，因此RPC适合在水-有机溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分子蛋白质的分离纯化、而HIC过程的洗脱条件要温和得多，通常降低洗脱剂的盐浓度就能达到目的，因此HIC既利用了蛋白质的疏水性质，又能够在更为极性和低变性的环境中进行，因而在蛋白质的纯化中有着更为广泛的应用。
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流动相条件对HIC的影响主要表现在所用盐的种类和浓度、流动相的pH，以及其他添加剂的影响。HIC过程是在高盐浓度下实现样品的吸附，而后在低盐浓度下完成洗脱过程。显然，流动相中盐的种类和浓度是HIC中至关重要的参数。不同的离子，特别是阴离子在HIC中的作用是不同的。有些离子存在于溶液中时会促进蛋白质发生沉淀，它们能够增加疏水作用；而另一些离子的存在却会促进蛋白质的溶解，称为促溶盐类，它们的存在会破坏疏水作用。下表指出了不同离子对疏水作用的影响，表中左边的离子能够促进疏水作用，因而经常在HIC中使用，而右边的离子属于促溶离子，它们能破坏疏水作用，有时在对色谱介质进行清洗时可以用来洗脱一些结合特别牢固的杂质。
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在所用盐的种类已经确定的情况下，盐浓度的高低会影响到溶质分子与色谱介质的结合强度及色谱介质的结合容量。盐浓度的升高能促进疏水作用，因此HIC通常都是在高盐浓度下加样并完成吸附，而通过降低洗脱剂中盐浓度的方法进行洗脱。除此之外，色谱过程的起始盐浓度的高低还会影响色谱介质对蛋白质的结合容量。
溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境。一般情况，溶液的pH接近蛋白质的等电点，其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作用；远离其等电点，其疏水性减少，不利于与固定相配基结合，但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变溶液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。
不同盐类对疏水作用的强度有影响，层析中的选择性也不尽相同；盐浓度也随目标分子的疏水性而异，(NH4)2SO4常用0.75~2mol/L，NaCl为1~4mol/L；洗脱方式最常用降低流动相中盐浓度的方式洗脱，流动相B为含盐量较低的缓冲液，缓冲液类型与流动相A一致，B%由0→100。往流动相中添加有机溶剂 ，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱 ；往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来。
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