承接上文
4.2 从PBMC分离NK细胞
时间：5h
4.2.1 分离PBMC
55.编者注：此处操作翻译省略，作者使用Lymphoprep从50mL buffy coat分离PBMC，详情请见原文。
56.得到的PBMC检查是否有血液团聚物，如有，用70μm滤器过滤，2mM EDTA/PBS洗涤，室温离心。
57.检查是否有红细胞，如有，用红细胞裂解液裂解，2mM EDTA/PBS洗涤，室温离心。
58.用MACS缓冲液重悬，计数细胞。
4.4.2 从PBMC阴性选择分离NK细胞（按照Miltenyi“NK Cell Isolation Kit, human”方案）
59.加入MACS缓冲液至50mL。
60.室温280×g离心8min（ac=9，dc=9）。
61.按每107细胞40μL重悬于预冷的MACS缓冲液。
62.4°C孵育5min。
63.每107细胞加10μL抗体鸡尾酒。
64.涡旋3s混匀。
65.4°C孵育5min。
66.每107细胞加入20μL α-生物素磁珠和30μL MACS缓冲液。
67.涡旋3s混匀。
68.4°C孵育10min。
69.加入10到20倍反应体积的MACS缓冲液，洗涤细胞和磁珠。
70.室温280×g离心8min（ac=9，dc=9）。
71.离心同时，取一个预分选滤器置于LS柱顶部，加3mL MACS缓冲液润洗。
72.离心后，重悬细胞，按500μL MACS 缓冲液/LS柱/1×108细胞。
73.放置新收集管，收集流穿液，即NK细胞。
74.吸取500μL细胞至滤器（每根LS柱最多1x108细胞）。
75.加3mL MACS缓冲液洗涤分选柱三次。
76.室温280×g离心8min（ac=9，dc=9），弃上清。
77.用培养基重悬细胞并计数。
78.得到的NK细胞用于功能试验（见4.3部分）。或按1-2×106细胞/mL，在培养基中添加500-1000U/mL IL-2，37°C，21%O2 5%CO2，过夜(>16h)培养，激活NK细胞。
注：可用流式细胞术评估分离的NK细胞纯度，CD56+CD3-为NK细胞，CD56+CD3+为NKT细胞。
4.3 NK细胞对人原代乳腺癌细胞的功能试验
4.3.1 NK细胞细胞毒性试验
时间：4h+16h孵育
79.按20000个肿瘤细胞/100μL加至96孔圆底板，每个条件均设置重复，设置自发肿瘤细胞死亡的对照孔（只有肿瘤细胞不加NK细胞）。
注：建议设置易被NK细胞杀伤的阳性对照，如K562细胞系。细胞毒性试验可与单抗结合，预孵育肿瘤细胞和抗体触发抗体依赖的细胞毒性（ADCC）。
80.如下表，用培养基调整NK细胞浓度获得合适的E：T比：
81.转移不同浓度的NK细胞各100μL至相应的肿瘤细胞孔中。
82.37°C培养箱，21%O2 5%CO2，培养16h。
83.取出细胞培养板，放冰上。
84.4°C 787×g离心3min（ac=9，dc=9），弃上清，脉冲涡旋。
85.加200μL PBS。
86.4°C 787×g离心3min（ac=9，dc=9），弃上清，脉冲涡旋。
87.用PBS稀释Live/Dead Aqua到1×，即每999μL PBS加1μL Live/Dead Aqua。
88.每孔加25μL Live/Dead Aqua 1×。
89.4°C孵育30min。
90.200μL PBS洗涤。
91.4°C 787×g离心3min（ac=9，dc=9），弃上清，脉冲涡旋。
92.对于PanCK胞内染色，重复步骤44-53。
93.加200μL流式缓冲液重悬染色的细胞，流式细胞仪检测分析。
注：用200μL 1%PFA重悬固定细胞可以稍后再进行流式分析（染色之后最长4天）。
4.3.2 （可选）细胞分泌谱评估，即细胞因子检测
94.NK细胞细胞毒性试验之后可以收集上清液，将96孔板在4°C 787×g离心3min（ac=9，dc=9），小心吸取上清液，不要扰动沉淀，-80°C贮存。可以使用市面上的细胞因子检测试剂检测肿瘤细胞暴露后NK细胞的分泌谱。
注：细胞因子检测不能与CD107a试验一起进行，因为后者使用的Golgi Stop含有阻断胞内蛋白运输的Monensin。
4.3.3 NK细胞对原代乳腺癌细胞的脱颗粒（CD107a）试验
时间：4h+4h孵育
95.用培养基将NK细胞和肿瘤细胞的浓度都调整至1×106细胞/mL。
96.根据实验设置，每孔加100μL NK细胞悬液，即1×105细胞。
97.根据实验设置，每孔加100μL肿瘤细胞悬液，即1×105细胞。
98.对所有条件用培养基准备CD107a或同种型对照抗体混合液：
a. 每孔：5μL CD107a Horizon V450抗体+20μL培养基。
b. 每孔：0.5μL IgG1κ V450+24.5 μL培养基。
99.根据实验设置，向NK-肿瘤悬液直接加25μL CD107a抗体混合物或同种型对照混合物。
100.用培养基稀释BD Golgi Stop 10×至1×。
101.37°C孵育1h。
102.每孔加6μL稀释得到的BD Golgi Stop 1×，37°C再孵育3h。
103.取出培养板，放冰上。
104.转移细胞至96孔深孔板，在冰上进行流式染色。
105.向深孔板中的细胞加200μL PBS。
106.4°C 787×g离心3min（ac=9，dc=9）。
107.小心地弃去上清。
108.用PBS稀释Live/Dead Aqua到1×，即每999μL PBS加1μL Live/Dead Aqua。
109.每孔加25μL Live/Dead Aqua 1×。
110.4°C孵育30min。
111.400μL PBS洗涤。
112.4°C 787×g离心3min（ac=9，dc=9）。
113.小心地弃去上清。
114.按下表，每孔加入50μL抗体混合液：
115.重复步骤110-113。
116.加200μL流式缓冲液重悬染色的细胞，流式细胞仪检测分析。
注：用200μL 1%PFA重悬固定细胞可以稍后再进行流式分析（染色之后最长4天）。与细胞毒性试验类似，脱颗粒试验建议设置阳性对照，并可与触发ADCC的单抗结合。
5. 预期结果
6. 定量与统计分析
6.1 NK细胞细胞毒性试验
NK细胞介导的细胞毒性计算为Live/Dead+肿瘤细胞（PanCK+）百分比。为了计算特异的细胞毒性，需要对自发的肿瘤细胞死亡进行校正。
6.2 NK细胞CD107a试验
NK细胞脱颗粒计算为总NK细胞（CD56+CD3-）中的CD107a+细胞百分比。NK细胞在肿瘤暴露后的脱颗粒应该对“仅NK”条件下的自发脱颗粒进行校正。
细胞毒性试验的圈门策略[2]
脱颗粒（CD107a）试验的圈门策略[2]
参考文献
[1] Laskowski TJ, Biederstädt A, Rezvani K (2022) Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy. Nature Review Cancer 22: 557-575.
[2] Beelen NA, Ehlers FAI, Kooreman LFS, Bos GMJ, Wieten L (2022) An in vitro model to monitor natural killer cell effector functions against breast cancer cells derived from human tumor tissue. Methods in Cell Biology doi.org/10.1016/bs.mcb.2022.05.001
人肿瘤解离试剂盒
人肿瘤细胞分离试剂盒
人NK细胞分离试剂盒
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