细胞治疗工艺创新分享——外周血来源CAR-NK整体解决方案

赛默飞实验室产品和服务

2022.1.13

作者赛默飞

TA的动态

NK细胞治疗前景

NK (Natural Killer) 细胞, 是一类从骨髓中淋巴干细胞系CD34+来源并分化且表达CD56表面抗原，但缺少CD3表面抗原的淋巴细胞。不同于T细胞介导的免疫识别，NK细胞不需要T细胞表面受体去识别特异的肿瘤抗原，而是可以非特异性的杀死肿瘤细胞。NK细胞不仅能杀死恶性疾病的细胞，还能分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α来参与固有免疫的调节，在肿瘤免疫中扮演重要的角色。

目前已经有两款上市的CAR-T免疫疗法产品应用于血液瘤患者，而CAR-T对实体瘤的治疗尚未取得突破。相较于CAR-T，CAR-NK具有诸多优势。首先，NK细胞的特性可实现利用异体细胞进行大规模培养，无需HLA匹配，不会诱发细胞因子风暴效应，是一个现货免疫细胞的理想选择。此外，CAR-NK对实体瘤治疗具有良好的临床应用前景。

NK细胞治疗产品开发技术路线及面临的挑战

肿瘤患者中的NK细胞由于受到肿瘤微环境的影响，无法实现对抗肿瘤的功能。因此，大量的科学研究人员开始了异体NK细胞疗法的研究和开发。NK细胞的来源主要包括脐带血、单采血、NK92细胞系和iPSCs。对于脐带血来源，NK细胞约占其总细胞量的30%；对于PBMC来源，NK细胞约占其总细胞量的5-20%。对于不同来源的NK细胞，功能差异尚不明确。

第三种来源是由日本科研团队发明的诱导多能干细胞（iPSCs），其原理机制是通过诱导iPSCs获得NK细胞。iPSCs具有无限增殖的能力，可以诱导为其他类型的细胞，如NK细胞、T细胞、胰腺细胞、肝脏细胞。这种发明为再生医学和细胞免疫治疗等领域展示了行业发展的前景。

临床数据显示，在外周血来源的NK细胞和iPSCs诱导的NK细胞上表达特异性识别肿瘤抗原的CAR基因后，CAR-NK细胞表现出比没有经过CAR基因修饰的NK细胞更强的抗肿瘤活性。

CAR-NK逐渐成为肿瘤免疫疗法的新兴方向，但是CAR-NK的生产流程还有许多挑战尚待解决。首先，血液来源中的NK细胞比例大约为10%，所以细胞的高倍数扩增成为了NK细胞培养的一个主要难题。其次，由于NK细胞具有通过自然杀伤来控制病毒的感染功能，基于病毒载体的细胞转导策略无法高效应用在NK细胞的基因改造，如何提高外源基因转导效率成为了NK细胞治疗的另一个亟待突破和解决的难点。

赛默飞外周血来源CAR-NK工艺解决方案

赛默飞以CTS™ Rotea™逆流离心系统，CTS™ Dynabeads™ ，CTS™ Xenon™ 大规模电转染仪等CTS系列设备和服务为核心，结合高品质的原材料，以及在线分析和质控分析解决方案，为细胞与基因治疗行业打造了“细胞治疗系统 CTS(Cell Therapy Systems)工艺开发平台，为CAR-NK的生产提供封闭式、模块化的全流程解决方案。本文将重点展开介绍针对外周血来源CAR-NK工艺解决方案。

赛默飞外周血来源CAR-NK工艺流程解决方案

PBMC分离与NK细胞富集

异体外周单采血是现在临床中主流的NK细胞来源方式，行业中较为通用的细胞分选方式是首先对PBMC进行分离。在研发期大都使用开放式手工操作的方式，但手工操作会在关键步骤对细胞产品引入较大的风险，包括人为操作误差和污染引入等问题，致使细胞产品最后生产失败。单采样品来源的不同会导致起始细胞状态即产生差异，如何从不同的样本分离足够量的NK细胞进入下游的生产，需要引入灵活的处理方式籍以调整。

Gibco™ CTS™ Rotea™逆流离心系统提供了封闭式、半自动化且灵活可以调整的生产模式用以分离NK细胞。该生产模式下，首先可使用Gibco™ CTS™ Rotea™洗除单采保护剂和血液中血浆和血小板组分，从而富集PBMC组分。分离后的PBMC再与Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28磁珠共同孵育，搭配Gibco™ CTS™ DynaMag™ 磁力板去除掉CD3+ T 细胞，从而获取高比例的NK细胞组分。Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28磁珠可以有效去除PBMC中的CD3+ T细胞，从而获得高纯度的NK细胞样品，已在大量研究中成功用于 T 细胞的体外分离和去除。Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28磁珠的生产与质量控制符合 ISO 9001和 ISO 13485的要求，其已在FDA备案，并具有DMF文件。整套分离NK细胞方案均采用了封闭化的操作流程，极大程度降低了生产过程中污染引入的风险。

NK细胞扩增培养

将NK细胞富集后所获取的样品扩增培养至临床可回输剂量，是当前NK细胞培养的一大难点。Gibco™ CTS™ NK-Xpander培养基是赛默飞为NK细胞专属研发的一款培养基，无需饲养层细胞，即可高效扩增NK细胞。连续14天的细胞平均扩增倍数高达1500倍，且能维持细胞表型和杀伤毒性的能力，有效解决了NK细胞富集后样品难以扩增至临床回输剂量的困扰。如下展示了Gibco™ CTS™ NK-Xpander™培养基静置培养单种NK细胞17天后的扩增倍数以及20种不同来源的NK细胞在Gibco™ CTS™ NK-Xpander™培养基和竞品培养基中培养14天后扩增倍数，两个数据表显示了NK细胞在Gibco™ CTS™ NK-Xpander™培养基下的扩增培养优势。

CTS™ NK-Xpander™培养基静置培养NK细胞17天后的扩增倍数

20个不同来源的NK细胞14天后平均扩增倍数

Heracell™ Vios™ CR洁净室专用 CO2 培养箱可以用于小规模的NK细胞培养，内置风扇的主动空气循环为提高细胞活力创造了均匀的培养条件。主动颗粒控制系统具有第三方认证的 ISO 5 级和 GMP A/B 级洁净室兼容性（包括 HEPA 过滤）。拉丝不锈钢外壳，电抛光内饰，180°C 灭菌循环，符合 IP54 防护等级。与外部数据采集系统对接的 4-20mA 数据输出。

Thermo Scientific™ Heracell™ Vios™ CR CO2 培养箱 – CTS 系列

HyPerforma™ Glass Bioreactors玻璃生物反应器提供了从3L至15L的不同培养规模的罐体，具备基于DeltaV平台的专业控制系统和强大的TruBio工艺控制软件，能适配复杂补料过程和灌流工艺，支持线性放大至最大5000L的一次性生物反应器中。Smart Glass台式反应器采用了模块化的设计，可自由选择额外的蠕动泵模块和配置气体混合通路，同时可选配适配器支持市面上各种不同厂家的玻璃罐体和硬质一次性罐体，达到工艺的最优选择。

HyPerforma™ Smart Rocker 是在传统的波浪式生物反应器基础上优化开发出的一次性生物反应器（最大50L规格）。采用和玻璃罐完全相同的DeltaV控制平台平台和TruBio工艺控制软件，具备复杂工艺和培养袋定制化支持的能力。Smart Rocker还具有运动模式调节功能，可选择4种不同的振摇模式，有效降低培养过程中的剪切力。

NK细胞基因工程改造

NK细胞完成大规模体积培养后，需对其进行基因工程改造。利用非病毒载体进行NK细胞基因工程改造是行业的首选。非病毒载体的细胞的基因工程改造有多种方式，包括物理法（电转染），化学法（脂质体等脂类，多聚物等）。电转染是最早和应用最广泛的非病毒转染策略之一。电转染可以实现将蛋白质、DNA、RNA等大分子转导至细胞中。使用电转仪对进行电转液置换后的NK细胞进行电转。电转的优势在于能够高效地转导外源基因，且制备载体较之病毒载体耗时短、成本低。但目前市面上的电转染技术应用于细胞治疗时存在诸多不足，一是如何在不牺牲细胞活率和回收率的情况下实现快速、高效的转染；二是无法满足GMP的封闭式工艺需求。

Invitrogen™ Neon™ 电转系统针对小剂量的研发阶段而开发。实现高达90%的电转和基因编辑效率，尤其针对于难以转染的细胞，如免疫细胞、干细胞和原代细胞。在该开放的系统下，可实现电转参数的调整和优化，易于实现2x104到6 x 106细胞的转染。

Gibco™ CTS™ Xenon™是赛默飞最新推出的用于细胞治疗工艺开发和GMP生产的大规模电转染系统，其主要特点有：

• 处理量大且快速：处理量为 1–25 mL，25 分钟内能够转染多达 2.5 x 109 个 T 细胞

• 性能可靠，可保持高细胞活率：高达90%的基因敲除效率和80%的细胞活率

• 工艺灵活性高：仪器配备了用户可编程系统，允许用户在细胞治疗的工艺开发到商业化生产的所有阶段，根据各种细胞类型和目标递送物创建并优化电转染方案。

• 非病毒性物理转染：可用于递送 DNA、RNA 和蛋白质

• 封闭式系统处理工艺：MultiShot (MS) 耗材可以无菌焊接至 PVC 管或 C-Flex 管

Gibco™ CTS™ Rotea™ 逆流离心系统可以实现最低5ml输出体积。可以应用于NK细胞的电转液置换，与Gibco™ CTS™ Xenon™实现封闭式工艺衔接。

细胞收获与制剂

经过大规模扩增后的NK细胞，如大于10L的体积，可以预先使用 CentriPAK™一次性使用离心袋在 Sorvall™ BIOS 16离心机进行预浓缩处理。随后使用Gibco™ CTS™ Rotea™进行洗涤和浓缩，细胞回收率约90%，活率展示出令人满意的结果。而且Gibco™ CTS™ Rotea™逆流离心技术可以通过调整离心速度和流速，使力产生不平衡，以此分离大小不同的细胞类型。能去除死细胞和细胞碎片，从而优化输送前细胞的活性。

CentriPAK™和 Gibco™ CTS™ Rotea™的一次性封闭系统组合可有效降低细胞分离操作过程中的污染风险，减少繁杂的容器清洗验证过程，提高细胞治疗产品的生产效率。

CTS™ Rotea™洗涤浓缩NK细胞后的活率和回收率

产品冻存

CAR-NK等新型细胞疗法的终产品的体积较大，袋数较多，液氮式的程序降温仪的高容量是细胞治疗产品冻存的首选。基于细胞治疗市场对设备的数字化追溯以及文本验证要求，CryoMedTM程序降温仪预设的和用户自定义的降温配置文件让用户可以根据细胞类型确定降温速率。集成触摸屏用户界面 (UI) 可以记录仪器使用情况和事件，同时该仪器也配置了一个 USB 端口，可轻松导出数据（.pdf、.csv 和 .run 文件）。PDF 文件导出满足 21 CFR part 11 的要求。

总结与展望

异体的NK细胞的扩增培养和基因修饰会提高NK细胞的肿瘤杀伤能力。CAR-NK细胞治疗将会在未来的抗肿瘤治疗策略中扮演至关重要的角色。赛默飞的工艺解决方案将助力CAR-NK细胞治疗解决工艺上的挑战，加速临床转化并最终服务于更多的病人。

我们将持续为大家分享新的细胞治疗工艺创新解决方案。敬请期待。