景杰生物 | 报道
肝细胞癌（HCC）是一种常见的肝脏恶性肿瘤，也是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一，主要发生在慢性肝病（如乙型肝炎、丙型肝炎、脂肪肝等）患者中。深入了解HCC的生理病理机制和发展规律，可以为HCC的早期预防、诊断和治疗提供新的思路和方法。以前的研究表明，HCC组织中普遍存在SIRT3低表达的现象，且SIRT3的低表达与HCC患者的不良预后有关[1]。此外，SIRT3还可以通过引起缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的不稳定而抑制Warburg效应，进而抑制肿瘤进展。然而，SIRT3调节HCC进展的机制仍未得到深入研究。
2023年3月，中国科学技术大学生命科学与医学部王毅团队及合作者在著名学术期刊EMBO Reports发表题为”SIRT3-dependent delactylation of cyclin E2 prevents hepatocellular carcinoma growth”的研究性论文，研究通过乳酸化修饰组学鉴定了HCC细胞中SIRT3调节的乳酸化修饰蛋白和位点。结合生化实验和晶体学等研究手段，研究揭示了HCC中SIRT3的表达下降促进细胞周期蛋白（CCNE2）的乳酸化修饰，进而促进肿瘤进展的机制[2]。景杰生物为该研究提供了乳酸化修饰以及乙酰化修饰抗体。
1 HCC组织和细胞中的SIRT3低表达与高水平的乳酸化修饰水平有关
首先，研究者在中国人群乙肝相关性HCC大队列蛋白质组学数据集中分析了SIRT3的表达水平[3]。相比于SIRT1和SIRT2，HCC组织中的SIRT3表达要显著低于癌旁的正常组织，且SIRT3的表达随着肿瘤的进展而降低。在3例的HCC患者的配对组织中，研究者同样发现了SIRT3在肿瘤组织中的低表达，同时，乳酸化修饰水平在肿瘤组织中高表达。在人源的HCC细胞系Huh-7中，研究者通过过表达SIRT3及其功能缺失的突变体（H248Y）以及调节乳酸含量等手段，证明了HCC细胞中的乳酸化修饰水平受到SIRT3的调节。
图1 HCC组织和细胞中的SIRT3低表达与高水平的乳酸化修饰有关
2 乳酸化修饰组学鉴定SIRT3调节的乳酸化修饰蛋白和位点
目前，基于质谱的乳酸化修饰组学是高通量、准确鉴定和定量乳酸化修饰蛋白和位点的有效工具。研究者利用乳酸化修饰组学和SILAC标记技术对正常的Huh7以及SIRT3过表达的Huh7细胞进行了分析。研究发现约52个乳酸化修饰蛋白可能受到SIRT3的调控，且将近94%鉴定到的乳酸化修饰位点的修饰水平在SIRT3过表达细胞中上调。此外，上述的差异修饰蛋白显著富集于细胞周期、核膜重组以及有丝分裂后期的通路。而在这些受SIRT3调节的乳酸化修饰蛋白中，CCNE2是一种细胞周期的关键蛋白，其K347和K348位点发生了乳酸化修饰。鉴于CCNE2在以前的研究中被证明能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，且CCNE2的高表达与HCC患者的较差预后有关。研究者随后推测SIRT3在HCC中的抑瘤作用可能是通过调控CCNE2上的乳酸化修饰水平所实现的。
图2 乳酸化修饰组学鉴定SIRT3调节的乳酸化修饰靶点和相关通路
3 CCNE2是SIRT3的去乳酸化修饰底物
通过将纯化的重组人SIRT3野生型蛋白或者SIRT3 H248Y功能突变蛋白与细胞裂解液中的CCNE2在体外共同孵育，研究证明了SIRT3具有直接从CCNE2蛋白上去除乳酸化修饰的能力，同时CCNE2的乙酰化修饰水平不会受到SIRT3的调控。上述研究证明了CCNE2是SIRT3的去乳酸化修饰底物。此外，研究者还利用结晶学对SIRT3催化CCNE2的去乳酸化修饰的机理进行了探究，结果表明CCNE2的乳酸化修饰位点可以结合SIRT3的催化口袋。而且，SIRT3上D156、F157和R158残基组成的环区可以发生显著的构象变化，促进乳酸化修饰位点与口袋的结合。
图3 CCNE2是SIRT3去乳酸化修饰底物
4 CCNE2的乳酸化修饰促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭
通过在Huh7细胞内过表达CCNE2野生型蛋白（WT），CCNE2的K347/K348Q（KQ突变体，模拟蛋白的赖氨酸乙酰化），或者K347/K348R（KR突变体，模拟蛋白的去修饰状态），并同时调节SIRT3表达水平，研究发现WT CCNE2过表达组的CCNE2乳酸化修饰水平最高，且其修饰水平受到SIRT3蛋白表达水平的影响，证明在细胞内CCNE2的乳酸化修饰水平同样会受到SIRT3的调节。此外，相较于过表达WT CNNE2的细胞，CCNE2的KR和KQ突变会导致细胞的增殖、迁移和侵袭受到显著的抑制。然而在WT CCNE2过表达的细胞中同时过表达SIRT3后，细胞的增殖会受到抑制。而且使用SIRT3的激动剂-和厚朴酚（Honokiol，HKL，一种中药提取物）对WT CCNE2过表达细胞进行处理后，肿瘤细胞的增殖同样受到了有效的抑制。综上，SIRT3通过调节CCNE2的乳酸化修饰水平抑制HCC的进展。
图4 CCNE2的乳酸化修饰促进HCC细胞生长
5 和厚朴酚HKL通过激活SIRT3抑制小鼠HCC进展
在小鼠的原位HCC模型中，和厚朴酚HKL的处理可以有效地改善肝脏病理性损伤以及抑制HCC细胞增殖，进而抑制HCC的进展。生物安全性评价结果表明HKL并未引起小鼠的体重改变，也未引起肾脏、脾脏的损伤。此外，HKL的治疗处理能够增强小鼠肝脏的SIRT3的表达，并抑制CCNE2的乳酸化修饰。上述结果表明，HKL通过激活SIRT3调节体内蛋白的乳酸化修饰水平，进而有效抑制HCC的生长，提示SIRT3可能是治疗HCC的潜在靶点。
图5 SIRT3激动剂HKL促进SIRT3表达进而抑制HCC在体内的进展
综上所述，本研究证明了HCC组织中SIRT3的表达水平降低与HCC的进展以及不良预后有关，而SIRT3表达与组织中的乳酸化修饰水平呈负相关。研究进一步通过乳酸化修饰组学鉴定了HCC细胞中SIRT3调节的乳酸化修饰蛋白和位点，并结合生化实验和晶体学等手段揭示了HCC中低表达的SIRT3通过促进细胞周期蛋白CCNE2的乳酸化修饰促进肿瘤进展的机制，也为SIRT3成为HCC精准治疗的潜在靶点提供了理论基础。
参考文献：
Zhang Y, et al. 2012. Sirt3 inhibits hepatocellular carcinoma cell growth through reducing Mdm2-mediated p53 degradation. Biochemical and Biophysical Research Communications.
Jin J, et al. 2023. SIRT3-dependent delactylation of cyclin E2 prevents hepatocellular carcinoma growth. EMBO Reports.
Gao Q, et al. 2019. Integrated proteogenomic characterization of HBV-related hepatocellular carcinoma. Cell.
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