作为生物学基础实验之一的Western Blot技术几乎是所有相关领域研究者每天必做的实验。但是,我们WB蛋白表达结果真的可靠吗?也许很多人都曾经怀疑过自己的Western定量结果,更加悲催的是在不断的重复实验中浪费青春,同时浪费着老板的课题经费!
其实……可能只是因为选错了内参……
有些Western实验中,内参的选择会带来不同的定量结论(特别是实验重复量不够的情况下,文献1)。dsi敲低E3连接酶表达后,FoxP1蛋白表达量会发生什么变化?
以actin为内参进行归一化定量,FoxP1没有明显表达差异;以β-tubulin为内参归一化后,FoxP1有上调(p=0.005);而以Stain-Free总蛋白为内参,我们可以得出非常明确的结论:FoxP1表达量会上调,符合理论预期!因为,在通常情况下E3连接酶会对FoxP1产生降解作用,所以在敲低E3连接酶后,FoxP1的表达上调是符合预期的。
这个实验案例中,不同的内参竟然会导致WB定量结果的差异:
actin内参没有得到统计学意义的结论;
β-tubulin内参虽有统计学上的差异,但是结果的CV略高;
Stain-Free内参不但显示了非常强的统计学差异,并且其CV值很低,与理论预期完全一致。
实在是太开脑洞了,原来困扰很多人的WB定量不准的问题出在内参的选择上!神奇的Stain-Free技术可以实现比普通管家蛋白更精准的WB定量!
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参考文献:Stain-Free total-protein normalization enhances the reproducibility of Western blot data, Analytical Biochemistry (2022)
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* 本产品仅用于科研用途,不用于临床诊断。