（图片来源：baotu）
缓冲液的作用是在一定的范围内缓冲调整溶液的pH值，使待测溶液的酸度符合分析方法所规定的范围。其中，磷酸盐缓冲液截止波长低于200nm，在较低分析波长下仍可使用，具有三个pKa值，可提供1.1~3.1，6.2~8.2，11.3~13.3三个pH缓冲范围，是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一。
配制磷酸盐缓冲液时，通常所说的浓度0.01M指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na+或K+的浓度，Na+或K+的作用是调节渗透压。
母液的配制：
● 0.2M Na2HPO4：精密称取 28.392g Na2HPO4，溶于1L水中，超声使溶解完全；
● 0.2M NaH2PO4：精密称取23.996g NaH2PO4，溶于1L水，超声使溶解完全。
各种浓度PB(pH=7.4)的配制：
先配0.2M PB（pH=7.4，100mL）：取0.2 mol/L的Na2HPO4母液81mL及0.2mol/L的NaH2PO4母液19mL，混匀。然后只需将0.2M PB（pH=7.4）按相应比例适当稀释即可，如：
● 0.1M PB（pH=7.4）：取500mL 0.2M PB，加水稀释至1L。
● 0.01M PB（pH=7.4）：取50mL 0.2M PB，加水稀释至1L。
● 0.02M PB（pH=7.4）：取100mL 0.2M PB，加水稀释至1L。
其它各种pH值的0.2M PB（100ml）配比：
pH
0.2M Na2HPO4（mL）
0.2M NaH2PO4（mL）
5.7
6.5
93.5
5.8
892
5.9
1090
6.0
12.3
87.7
6.1
1585
6.2
18.5
81.5
6.3
22.5
77.5
6.4
26.5
73.5
6.5
31.5
68.5
6.6
37.5
62.5
6.7
43.5
56.5
6.8
4951
6.9
5545
7.0
6238
7.1
6733
7.2
7228
7.3
7723
7.4
8119
7.5
8416
7.6
8713
7.7
89.5
10.5
7.8
91.5
8.5
7.9
937
8.0
94.7
5.3
以上配制方法可供参考。日常配制流动相时常使用缓冲盐搭配酸/碱溶液进行pH调节。
在使用酸/碱溶液调节缓冲溶液的pH时，使用低浓度（0.1mol/L）比使用高浓度（1mol/L）引起的误差更小，对缓冲溶液pH的重复性和分析结果的重现性更有优势，尤其是针对一些对pH敏感的分析项目。
（图片来源：baotu）
应用案例：
客户反馈参考应用报告的液相条件，同一台液相，不同天配制的流动相，配制方式一样，分离重现性不好，有时能分开，有时会重合无法分离。了解到客户称取磷酸盐后溶于1L超纯水中后，再滴加1mol/L碱溶液进行pH调节。此方法容易造成配制差异，引起峰分离情况差异。
优化流动相配制方法：
① 精密称取Mg±0.001g磷酸盐，溶于约800mL超纯水中溶解。
② 预先配制0.1mol/L氢氧化钠/氢氧化钾溶液，称样量Ng±0.001g，用量筒准确量取100mL碱溶液备用。
③ 将量取的碱溶液缓慢加入已溶解的磷酸盐溶液中，观察pH变化，达到目标pH后，停止加入碱溶液，记录所需碱溶液体积。
④ 再在缓冲盐溶液中加入超纯水定容至1L。
⑤ 后续配制只需量取固定体积的碱溶液加入固定称样量的缓冲溶液中，即可达到固定的pH。成功减小流动相配制差异，提高峰分离重现性。
效果见下图：
1）系统溶液谱图 操作员a配制的流动相
2）系统溶液谱图 （次日）操作员b配制的流动相
方法转移客户，测试后反馈分离重现性良好。
结论：
流动相pH的稳定性与准确性对样品分析的影响较大时，需尽量规避流动相配制时的人员误差，环境误差，仪器误差，物料称量误差等，以保证方法分析效果的重现性。
作者：况熙
排版：赵林
审核：任兴发
如果您想了解更多内容，欢迎联系月旭科技销售人员或拨打400-810-6969服务热线，我们将竭诚为您服务。
首页
