糖蛋白的糖肽图分析是一种极其有效的技术，可用于解析主功能区和肽段特异性的糖基化。通过对该技术进行扩展，沃特世开发了ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide 300Å 糖蛋白分析专用柱，其具有大孔径固定相和经优化的酰胺键，能够在完整糖蛋白、糖蛋白碎片或糖肽分析中实现MS兼容的HILIC分离，帮助您轻松获得：特异位点的糖基结构，糖基占据率，以及在完整糖蛋白、亚基、糖肽水平上确定糖基位置信息。采用此糖蛋白分析专用柱进行糖肽图分析，有望使蛋白质糖基化的表征达到前所未有的详尽程度。
本文将讨论使用 Glycoprotein BEH Amide 300Å 1.7 μm糖蛋白分析专用柱实现三种不同单克隆抗体的糖肽高分离度HILIC分离。
生物制药的肽图分析被长期用作鉴别测试和监测特定残基修饰的工具。在传统分析中，利用C18键合固定相并使用离子对试剂的反相分离的极高峰容量分离由高精度蛋白酶得到的肽。此类分离能够分辨单个氨基酸的差异，从而分离肽；并且能够分辨天冬酰胺脱酰胺化的两种潜在产物天冬氨酸和异天冬氨酸。
然而，并非所有的蛋白质修饰都可以如此轻松地通过RP分离得到分辨。相比之下，糖基化肽分离的选择性相对较差。因此，尽管RP分离有利于通用肽图分析，但其分辨亲水性修饰的能力有限。
通过对该技术进行扩展，我们开发出一种标称孔径较大的酰胺键合固定相，使得酰胺HILIC分离可通用于分离完整糖蛋白和消化糖蛋白的糖型。ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide 300Å 1.7 μm糖蛋白分析专用柱采用的这一固定相能够使无论尺寸如何的糖肽都能够进入多孔网络主体，且不易发生受限扩散。本文将讨论使用 Glycoprotein BEH Amide 300Å 1.7 μm糖蛋白分析专用柱实现三种不同单克隆抗体的糖肽高分离度HILIC分离。
结果与讨论
正交互补性糖肽图分析分离
为了展示传统的肽图分析方法，我们首先使用配备大孔径C18键合固定相的RP分离方法对mAb的Lys-C消化物进行LC-UV-MS分析。曲妥珠单抗的Lys-C消化物的典型UPLC色谱图，其中采用梯度分离时，肽获得了良好的分离。用于获得这一高分离度分离的条件包括使用以三氟乙酸改性的流动相；同样的流动相被证明是采用HILIC分析蛋白质类分析物的最佳选择。因此，只需反转梯度并使用新开发的大孔径酰胺键合固定相，即可利用HILIC作为RP分离的正交方法。
通过HILIC-UV糖肽图分析对曲妥珠单抗糖基化进行批次间分析
基于HILIC-MS的糖肽图分析能够生成信息丰富的数据。然而，这些HILIC糖肽图分析还有利于仅基于光学检测的方法。通过对比糖肽图谱中的峰面积，我们发现两批曲妥珠单抗确实存在糖基化方面的差异。具体而言，从FA2、FA2G1和FA2G2糖型的丰度不同即可看出，这些批次的曲妥珠单抗的末端糖基化程度有所不同。该结果与此前的游离糖基分析及此前基于HILIC的曲妥珠单抗亚基分析所获得的数据一致。
利用主功能区和肽段特异性的mAb糖基化信息完善GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖分析
糖肽图分析的引人注目之处在于它可用于解析主功能区和肽段特异性的信息。通过推断或/和ETD碎裂分析，还可使用糖肽图分析详细解析糖基化的精确位点。正如我们所指出，IgG重链的Asn297处存在一个保守的N-糖基化位点，意味着它们将由Fc亚基中的两个糖基进行修饰。此外，某些IgG甚至某些mAb IgG疗法采用了多功能区糖基化。
Glycoprotein BEH Amide 300Å 1.7 μm糖蛋白分析专用柱性能基准测试
与其他色谱柱技术相比，该柱在示例性糖肽分离中获得的峰容量尤其值得注意。为了对Glycoprotein BEH Amide 300Å 1.7 m糖蛋白分析专用柱的性能进行基准测试，我们分析了NIST候选参比物质IgG1K mAb的Lys-C消化物。在该测试中，使用聚焦梯度以及肽内源性荧光代替短波长UV检测，从而可在获得的色谱图中实现更高的信噪比。源自mAb Fc功能区的糖肽中将包含Lys-C裂解产生的色氨酸残基，其在很大程度上使该检测机理成为可能。该分析表明，这些色谱柱的分离能力差异极大。Glycoprotein BEH Amide糖蛋白分析专用柱的有效峰容量达到72.8，其峰容量和性能比其他酰胺色谱柱高40%和96%。
结论
糖蛋白的糖肽图分析是一种极其有效的技术，可用于解析主功能区和肽段特异性的糖基化。在本研究中，我们证明使用ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide 300Å 1.7 μm糖蛋白分析专用柱能够实现糖肽的HILIC分离，为反相分离的色谱信息提供补充。此外，结果表明，相比于其他市售酰胺色谱柱，该HILIC分离可获得杰出的峰容量。其可兼容MS，意味着能够轻松采集信息丰富的数据对糖肽图进行表征。例如，本研究表明，它能够以相对直接的方式表征多功能区蛋白质糖基化，例如曲妥珠单抗的Fc和Fab功能区糖基化。与其他最新开发的策略(例如HILIC亚基分析和GlycoWorks RapiFluor-MS游离N-糖分析)相结合，采用ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide糖蛋白分析专用柱进行糖肽图分析非常有望使蛋白质糖基化的表征达到前所未有的详尽程度。
如需进一步了解，
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