01
Western blot为什么需要
Loading control
传统Western blot最终需通过条带灰度值来反映样品中蛋白质表达水平高低。但western blot在多个步骤中可能会引入误差，比如样品稀释误差，上样体积误差，转膜效率差异等。为了克服这些误差，传统western blot引入内参蛋白（Housekeeping Proteins (HKPs)）作为loading control进行误差校正。最后通过靶蛋白灰度值比内参蛋白灰度值进行相对定量，比较组间蛋白质表达水平差异。
02
内参蛋白作为loading Control的关键考察点及不足
内参蛋白的两个关键考察点
内参蛋白是否受组织来源和实验处理的影响
内参蛋白和靶蛋白都应在线性区间内
内参蛋白受组织来源和实验处理的影响
内参蛋白Actin，tubulin，GAPDH等均为功能明确的蛋白质，在实验中可能会受到不同组织来源以及不同实验处理等影响，因而无法保证其不会影响相对定量的结果。不断有文献报道，内参蛋白可能影响western blot技术定量的准确性。
1. 内参蛋白在不同组织来源中表达量不同
Total Protein Analysis as a Reliable LoadingControl for Quantitative Fluorescent Western Blotting,doi:10.1371/journal.pone.0072457.
（爱丁堡大学罗斯林研究所和皇家（迪克）兽医研究所）
解读：在总蛋白基本一致情况下，Actin在肌肉，心脏，骨骼，头颅骨，脾脏，脂肪中表达差异极大
Housekeeping proteins: A preliminary studyillustrating some limitations as useful references in protein expressionstudies, Proteomics.2005Feb;5(2):566-71.cc英国癌症临床研究中心
解读：
在总蛋白基本一致情况下，常用内参蛋白在前列腺，盲肠，胃，肾上腺，膀胱，肺脏，心脏，子宫，脊髓表达差异。在部分组织，部分内参蛋白可不表达。
2. 内参蛋白在不同实验处理组中表达量不同
An overview of technical considerations forWestern blotting applications to physiological research，Scand J Med Sci Sports.2017Jan;27(1):4-25.
诺丁汉大学医学研究中心
解读：
总蛋白一致情况下，IGF-1处理可同时上调内参蛋白表达和靶蛋白。
An overview of technical considerations forWestern blotting applications to physiological research，Scand J Med Sci Sports.2017Jan;27(1):4-25.
诺丁汉大学医学研究中心
解读：
总蛋白一致情况下，正常组织和肿瘤组织内参蛋白表达不同。
内参蛋白和靶蛋白都应该在线性范围之内
除了靶蛋白需要在技术的检测线性范围内，内参蛋白也需要在线性范围内。因为内参蛋白通常为高表达量蛋白质，故需要预实验确认抗体稀释度区间，而常见抗体说明书推荐浓度只是能够检出内参蛋白质条带，比如1：5000，1：10000，甚至1：20000。但内参蛋白为高丰度蛋白，在抗体稀释度高的情况下，存在内参蛋白抗原过量，但抗体可能不足量，无法显示出内参蛋白质在不同组间的差异。
1. 靶蛋白不同，线性范围不同
2.内参蛋白的线性范围窄，无法满足所有靶蛋白的线性范围
Total Protein Analysis as a Reliable LoadingControl for Quantitative Fluorescent Western Blotting,doi:10.1371/journal.pone.0072457.（爱丁堡大学罗斯林研究所和皇家（迪克）兽医研究所）
03
总蛋白作为loading control 归一化定量是Western Blot相对定量的必然趋势
因内参蛋白的表达会受到各种因素如不同组织来源，不同实验处理等因素的影响。因此，归一化样本间内参蛋白的表达差异将导致研究的目标蛋白相对定量不准确，甚至得出错误的生物学结论。
为此另一种归一化方案——总蛋白归一化，必然成为Western Blot相对定量的趋势。此方法将样本中的总蛋白量信号作为内参，不依赖于抗体，不受抗体和靶蛋白结合的线性范围影响，且最大程度减少了内参蛋白自身表达差异对定量的影响。
Jess
Jess是ProteinSimple 2018年7月推出的新一代全自动定量western blot系统，整合了化学发光，多色荧光及总蛋白归一化定量三种定量模式。
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