序列覆盖度是用于评估肽谱的指标之一。有时我们仅关注几种关键的肽，但有时关注整个蛋白质序列非常重要。那么，在没有实现 100％ 序列覆盖率时我们能做些什么？给你最新的排查攻略，只需 6 步可以让您的排查工作效率翻倍，更有相关应对措施免费奉送。
第一步：审查蛋白质数据和序列，查看缺失多少序列以及哪些理论上的肽段未检测到。
如下面第一个例子所示，缺失的是单个氨基酸，还是非常小的二肽或三肽？
例如，序列是否包含连续的赖氨酸残基？用于肽谱分析的反相色谱通常不会保留这些物质。
这一曲妥珠单抗肽谱对每条链的序列覆盖率为 98.49％。带灰色下划线的氨基酸是未检出的部分。轻链中缺失一个二肽 (HK)，而重链中则缺失两个二肽（AK 和 SR）和一个四肽 (GQPR)。
在这种情况下，后续可能采取的步骤为：
第二步：判断是否继续使用现有方法
情况 1：如果那些残基无关紧要，我们可以继续使用现有的数据和肽谱分析方法。
情况 2：如果检出那些氨基酸至关重要，则有两个措施可选：
措施 1：选择产生不同裂解位点的不同的消化酶。胰蛋白酶因其可预测性通常是首选的蛋白酶，但是还有很多其他选择。
措施 2：改变酶解方案，例如缩短酶解时间，以产生不完全酶解。
另一点需要注意的是，
第三步：未检测出的是否为亲水性小肽段？
措施：并非所有 C18 色谱柱都相同，有些色谱柱的保留特性强于其他色谱柱。采用不同的 C18 色谱柱可能是一种解决方案。
第四步：缺失的肽段非常大还是具有疏水性？
例如，曲妥珠单抗的轻链和重链都具有互补决定区，该区域包含非常长的疏水性肽，这种疏水性肽可能难以检测。
第五步：在这种情况下，如何重新获得这些肽取决于肽遗失的位置。
情况 1：肽可能粘连到与其接触的任何表面上，包括移液枪头、样品储存管或自动进样器样品瓶。更换供应商或材料可能有所帮助。
情况 2：重新审视样品前处理方案——疏水性特别强的肽能否沉淀？乙腈是沉淀溶液中蛋白质的一种简单而常用的方法。
情况 3：如果肽粘附到色谱柱，可以尝试以下操作：
措施 1：能否换用有机相含量更高的流动相？或者能否在（可能使用）的乙腈流动相中添加更强的有机溶剂（如异丙醇）？下面展示了一个例子。
措施 2：更换色谱柱固定相也可能是一种解决方案。
第六步：最后，与肽可能粘连的位置无关，再次回到序列上：是否有缺失裂解？
措施：调整酶解方案或采用不同的蛋白酶可能会有所帮助。或者甚至更简单，在搜索数据时是否允许缺失裂解？其实这是一道多选题，也许选中复选框正确答案就呼之欲出！
这一 mAb 肽谱仅有约 75％ 的序列覆盖率——这绝对有问题。观察下面的序列，发现有一些非常大的肽段缺失。轻链上缺失的一个肽段长 42 个残基，重链上缺失的另一个肽段包含 63 个氨基酸！胰蛋白酶裂解的肽段平均仅有 6 个残基1，方法也据此进行开发。在这种情况下，梯度没有达到足够高的有机相含量——仅含 19％ 的乙腈。通常肽分子越大，则需要使用有机相百分比更高的溶剂将其洗脱。
罗列出每一种肽的所有缺失原因几乎是不可能的。有时，重新获得一个缺失的肽的步骤会导致另一个肽丢失，这需要如消化酶组合等方法。
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下次再见！
参考文献：
1.P. Giansanti, L. Tsiatsiani, T.Y.Low, A.J.R.Heck.Six alternative proteases for mass spectrometry-based proteomics beyond trypsin.Nature Protocols, 2016.
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