在色谱方法开发过程中,分离度、柱效、峰形是考察色谱柱选择性是否合适的主要性能指标。
根据分离度(Rs)公式,分离度的影响因素主要有柱效(N)、选择性(α)和保留因子(或称容量因子,k):(公式1)公式1作为分离度改善的理论基础。通常,方法开发过程中,通过提高化合物保留 (k)、提高柱效 (N)、以及提升选择性 (α) 来达到分离度的改善。(公式2)式中 k1 和 k2 分别是第一个峰和第二个峰的保留因子。根据公式 1 和公式 2,当选择性因子提高 0.1 时,对分离度的贡献是 Rs 大约为原来的 1.8 倍。因此选择性的改变对分离度的改善效果显著,如图 1 所示。- 固定相:选择不同化学修饰的键合相(不同的 C18 柱或其它键合类型色谱柱)
- 流动相:调整有机相的类型、pH 值、盐浓度、两相比例等
柱温
在色谱固定相的选择和使用中,最常用的键合相类型是十八烷基硅烷键合硅胶(C18)。不过,由于固定相物理特性与化学修饰的差异,使得不同的 C18 选择性不尽相同。选择色谱柱时,如果一种类型的 C18 柱分离度不足,就可以选择与之选择性差异较大的 C18 柱来进行优化。以 Agilent InfinityLab Poroshell 系列中的 C18 液相色谱柱为例:因此,表面化学结构的差异,三种常用的 Poroshell C18 柱,在选择性上具有显著区别。表 1列出了以 EC-C18 为基准,HPH-C18 与 SB-C18 的相似度因子 Fs。当 Fs 因子大于 3.0时,固定相选择性存在差异。表 1. 三种固定相选择性差异比较(以 EC-C18 为基准)Poroshell 色谱系列在色谱分析行业已经得到了广泛的认可,安捷伦也一直在拓展 Poroshell 系列色谱柱的产品线。2020 年 11 月,安捷伦推出了新产品 Poroshell CS-C18 柱,进一步拓展了 C18 固定相的类型。该固定相是在 Poroshell 实心核颗粒的表面多孔层在进行高 pH 耐受的杂化处理之后,再进行 C18 键合、封端和正电荷修饰,其中使用的键合相还进行了侧立基的保护。这样 CS-C18 固定相的表面,不仅具有 C18 提供的疏水作用、而且还具有正电荷的离子作用,选择性也与其它的 C18 键合相有显著差异。同时,硅烷链侧立基保护、多孔硅胶表面杂化处理,使得固定相pH耐受范围得到了拓宽。在 Poroshell C18 的四种 C18 键合相中,涵盖了 RPLC 模式下的主要作用力,选择性彼此之间有显著差异,见图 2。利用这些固定相的选择性差异,可以方便地进行方法开发中的色谱柱选择。图 2. Poroshell 的 4 种 C18 固定相在 pH=10 的体系下,耐碱的 CS-C18 与 HPH-C18 选择性存在显著差异。图 3. 农药组分在碱性体系下 LC-MSMS 色谱图结果比较在酸性体系下,不同 Poroshell C18 柱的保留、分离度有显著差异。图 4. 阿片类药物在酸性体系下 HPLC 分析色谱图比较在酸性体系下,在碱性药物阿米替林的杂质分析时,采用 CS-C18 与传统封端的 C18 柱进行比较,CS-C18 柱对碱性组分具有更好的峰形、载样量和分离度。图 5. 不同色谱柱对阿米替林及杂质(0.25%)不同进样量分析结果比较在甲酸体系下,在进行液质联用分析时,CS-C18 柱提供可更好的灵敏度、响应和峰形。
图 6. 甲酸体系中低浓度标样(50ng/ml) 在 LC/MS/MS 中灵敏度比较四种不同的 Poroshell C18 柱还有哪些应用?新产品 Poroshell CS-C18 还有哪些优势和特性?方法开发过程中色谱柱的选择性是如何比较的?
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参考文献:
1. L. R. SNYDER , J. J.KIRKLAND, J. W. DOLAN. Introduction to Modern Liquid Chromatography, ThirdEdition.
2. 液相色谱手册-液相色谱柱与方法开发指南. 安捷伦科技.5990-7595CHCN
3. Agilent InfinityLabPoroshell 120 CS-C18 助您将 pH 值用作方法开发工具. 安捷伦科技. 5994-2274ZHCN
4. 使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 CS-C18 色谱柱改善碱性分析物的峰形. 安捷伦科技. 5994-2094ZHCN
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