布鲁克文章推荐 第37期
Bruker Journal Club
布鲁克纳米表面仪器部 王鑫 博士
造血细胞和血小板通过G蛋白偶联受体(GPCR)感知细胞外的信号，并通过启动整合素(integrin)介导的细胞黏附。非造血细胞能否通过蛋白酶激活G蛋白偶联受体引发整合素介导的细胞黏附尚不明确。苏黎世理工大学(ETH)Daniel J. Müller教授及其团队使用单细胞力谱技术研究了在不同蛋白酶诱发条件下细胞黏附特性的变化，从而构建起化学信号诱发的细胞黏附模型。研究发现，蛋白酶活化的PAR1与PAR2受体可以诱导多个信号通路以引发α5β1-整合素介导的细胞黏附。首先，通过PAR系列受体通过Gβγ和PI3K信号通路使α5β1-整合素转变为与talin和kindlin相对应的高亲和力构象，高亲和力的α5β1-整合素与纤连蛋白的结合开启细胞黏附。PAR系列受体在随后的60秒内通过Gα13、Gαi、ROCK与Src等一系列信号通路增强α5β1-整合素介导的细胞黏附。相关成果(Protease-activated receptor signalling initiates α5β1-integrin-mediated adhesion in non-haematopoietic cells)于2020年1月20日发表在《Nature Materials》杂志上(Nat. Mater. 2020, 19, 218. DOI: 10.1038/s41563-019-0580-4)。
细胞外基质(ECM)与细胞的黏附特性对哺乳动物的正常生理功能起着至关重要的作用，异常的黏附会导致多种严重的疾病，包括出血性疾病、皮肤病、骨质疏松或者癌症的发展与转移。整合素是ECM的主要受体，可以与ECM中多种短肽结合，研究较广泛的体系是ECM中纤连蛋白上的RGD氨基酸序列与β1或αV系列的整合素结合。整合素结合ECM并在细胞内招募kindlin和talin蛋白来启动细胞的黏附过程。PAR受体蛋白是G蛋白偶联受体家族的成员，PAR受体被膜外的蛋白酶切去保护序列之后，暴露出的信号序列与PAR受体结合激活PAR受体的下游通路。在造血细胞中，PAR受体参与血小板的聚集、炎症反应以及组织修复等过程。为了研究不同条件下细胞的黏附特性，纤维原细胞通过基因敲除的方法移除整合素获得不含整合素的细胞系(pKO)，并通过细胞工程获得使pKO特异性表达αVβ3-整合素或α5β1-整合素的细胞系(pKO-αV或pKO-β1)。细胞通过ConA蛋白粘在无针尖的悬臂上，探针将细胞在覆盖有纤连蛋白片段(FNIII7-10)的衬底上按压一段时间，随后探针拉伸细胞脱离衬底，并记录下细胞的最大黏附力，作为细胞黏附特性的表征。
未敲除整合素的、pKO-αV以及pKO-β1纤维原细胞经过PAR1受体或PAR2受体激活后，分别与带有RGD的衬底接触5秒、20秒以及60秒。由图1A可知，PAR1受体或PAR2受体活化的纤维原细胞在60秒时有着显著增强。PAR受体活化的pKO-αV以及pKO-β1纤维原细胞的黏附特性表明，pKO-β1在60秒时有着显著黏附增强。与之相比，pKO-αV在60秒内黏附力没有显著的提升，即使接触时间延长到240秒，PAR受体对pKO-αV的黏附增强作用仍然不明显。因此，PAR通路激活可以通过α5β1-整合素而非αVβ3-整合素增强早期纤维原蛋白的黏附作用。
细胞流式实验表明，PAR激活后的α5β1-整合素变构到高亲和力的构象。单细胞力谱技术可以用于评估α5β1-整合素的结合概率，以表征α5β1-整合素的亲和力。如图3所示，PAR2激活后，α5β1-整合素的结合概率显著增强。talin与kindlin蛋白的敲除实验表明，在极短的结合概率表征时间内，两种蛋白的招募不影响结合概率的测量。因此，PAR的激活使α5β1-整合素转变为高亲和力的构象。如图4所示，talin与kindlin蛋白的敲除的纤维原细胞TKO与KKO显著降低了黏附力。敲除talin的TKO纤维原细胞，表达talin1蛋白时，细胞黏附可以响应PAR的激活，而与之对应talin2蛋白没有相应的响应。因此talin1对在PAR受体激活时对整合素增强黏附的调节起着至关重要的作用。如图5所示，抑制剂对G蛋白亚基Gαi和Gβγ、ROCK激酶、PI3K激酶以及Src激酶的抑制作用均降低了细胞黏附对PAR2受体活化的响应。基于上述细胞黏附调控的实验，作者建立起非造血细胞在PAR受体激活调控下产生细胞黏附的模型(图6所示)。
该工作使用了Bruker配备CellHesion®模块的NanoWizard®系列生物型原子力显微镜完成。全新的NanoWizard® 4 XP BioScience AFM通过配备CellHesion®扫描器、CellHesion®模块或HybridStage™可提供高精度的Z方向大量程(>100 μm)，实现基于单细胞力谱的细胞黏附的测量。Bruker配备的PetriDishHeater™可以提供温度、气体氛围与液体环境的控制，可在37 ̊C的培养基中进行长时间活细胞实验。Bruker同时提供MLCT-O、NP-O等无针尖悬臂，用于单细胞力谱实验。
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https://www.nature.com/articles/s41563-019-0580-4
NanoWizard® 4 XP BioScience AFM简介：
https://china.jpk.com/products/atomic-force-microscopy/nanowizard-4-xp-bioafm
CellHesion®模块简介：
https://china.jpk.com/products/cell-tissue-mechanics-and-adhesion/cellhesion-module
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