Small:原子力显微镜与荧光漂白恢复技术（FRAP），定量揭示细胞对力响应的动态过程

布鲁克纳米表面仪器

2020.4.03

作者布鲁克纳米表面

TA的动态

布鲁克文章推荐第32期

Bruker Journal Club

布鲁克纳米表面仪器部樊友杰

活细胞是个生物力学实体。最近的研究表明，它们不仅调节由配体-受体结合等信号事件触发的下游细胞机制，而且还利用多种反馈机制来动态调整以应对外部应力刺激，而其中主要反馈机制涉及肌动蛋白细胞骨架的动力学。量化研究活细胞的自适应机制对于理解它们的内部工作和功能是至关重要的。然而，尽管建立了与细胞力学的独立测量及在作用力下的分子动力学相关的定量方法，细胞反馈机制控制其适应外部力学行为灵敏度的知识和相关证据仍然是缺乏的。

牛津大学的韦瑟罗尔分子医学研究所人类免疫组的Marco Fritzsche教授研究组利用JPK公司的NanoWizard 4原子力显微镜与基于Leica DMI8倒置显微镜的荧光漂白恢复技术（Fluorescence recovery after photobleaching）（见图1），可以同时定量分析活细胞中的分子动力学和细胞力学，并能实时将两者的数据直接关联起来，以达到实时定量关联两种数据的目的。

作者先用15--20um厚度用增强绿色荧光蛋白修饰的聚丙烯酰胺凝胶和使用光稳定染料phalloidin-Alexa488进行荧光标记的固定HeLa细胞来确定激光衍射光斑的大小和功率，以此来确定实验所用的相关参数。最后用粘有5um直径的聚苯乙烯小球的针尖来充当细胞外部的力刺激源。通过对目标区域（region of interest,ROI）施加不同大小的作用时，观察ROI区域的荧光恢复的动力学过程（如图2），记录荧光漂白后的恢复时间（如图3），再用数值拟合的方法对荧光漂白的恢复时间进行拟合分析（如图4，图5），从而能对荧光漂白的反应动力学的扩散动力学进行定量的分析。

通过拟合发现，平均荧光转移速率与外界作用力的e指数相关。当外界应力作用达到35 pN/um2时荧光迁移速率变化的最为明显，且肌动蛋白微丝相对对照组改变了2倍的长度。实验发现在外力压入深度在2um内HeLa细胞的肌动蛋白纤维骨架的应力调节机制是最有效的。在这个外界应力范围内允许调节的迁移速率和在整个细胞质内骨架相互联系的肌动蛋白微丝可以看成是外界应力的相关函数。作者推测细胞对外力作用的反应是通过调节肌动蛋白的动力学来改变微丝的长度，从而达到细胞对外力刺激的动态响应。

相对于单独的荧光漂白恢复或是原子力显微镜，原子力显微镜与荧光漂白技术的联用有3个非常突出的特点：（1）胞内机械响应的定量测量；（2）细胞力学起源的机械学研究：活细胞的机械性能和机械力的产生可以在药物和遗传治疗的作用下得到动态的探究；（3）蛋白的动力学对细胞机械性能的影响：通过外加的机械作用力刺激细胞，并研究在此作用力下的蛋白分子的动力学过程。

该工作使用了Bruker旗下的JPK Nanowizard®4三轴分立的闭环、全针尖扫描的生物型原子力显微镜。最新的JPK Nanowizard®4XP系统还配备了Bruker专利技术的PeakForce Tapping,可以不用考虑针尖的动力学而非常轻易的成像。且还有专门针尖细胞成像的定量成像模式（QI）可以同时得到样品的表面形貌和机械性能的Mapping图。