关于标准的氨基酸分析方法的窍门——样品衍生化、反相分离和紫外检测，相信大家已经很熟悉了，但是这次与我们之前介绍的标准的氨基酸分析方法完全相反！HILIC（亲水相互作用色谱）最常用于生物制药中的糖链分析，但它也是分析细胞培养基中小分子极性代谢物的一种有效方法。 那么 HILIC 究竟厉害在哪里？它又是如何颠覆氨基酸分析的呢？
在许多领域中，反相色谱比 HILIC 更为常用。在 HILIC 分离中，固定相是极性的，初始流动相是非极性的，并且分析物大致按照亲水性最弱到最强的顺序洗脱，与反相分离相反。通过下面的两种氨基酸分离结果，您将会明白反相色谱与HILIC之间的不同.。
上面的色谱图是使用 AdvanceBio AAA 色谱柱得到的反相分离结果。亮氨酸和异亮氨酸及它们的脂肪族侧链是最后洗脱的几种氨基酸。下面的色谱图展示了使用最近推出的AdvanceBioMS Spent Media 色谱柱得到的 HILIC 分离结果。在这幅色谱图中，我们看到亮氨酸和异亮氨酸在大多数其他氨基酸之前洗脱。
但洗脱顺序并非完全相反，因为在该 HILIC 色谱柱上，分析物的电荷和流动相的 pH 将影响保留特性，我们可以看到，普遍规律为疏水性更强的分析物比亲水性更强的分析物更早洗脱。 HILIC 分离的窍门在哪里？
与固定相类似，流动相的使用方式也与我们在反相色谱中的使用习惯相反。HILIC 分离并非从高含水量流动相开始，而是从高有机含量流动相（通常是乙腈）开始。我们习惯以流动相 A 作为水相，流动相 B 作为有机相的惯例，这意味着流动相梯度通常从 90%–100％ 的流动相 B 开始。使通道 A 保持为水相，并使通道 B 保持有机相，更有利于在同一仪器上运行不同的色谱方法。
在深入探讨获得最佳 HILIC 分离结果的详细技巧以及氨基酸的 LC/MS 分析之前，请务必再次检查您的流动相！
方法的稳定性与所包含的各组分的稳定性息息相关，其中便包括流动相。 配制流动相可能看起来非常简单，而且往往确实如此，但是配制方法有时非常重要。
特别是对于 HILIC，流动相组成的微小变化可能产生重大影响。从下面的色谱图中，我们可以发现仅 1% 的流动相组成变化即可导致保留时间发生很大的改变。
图为用于 QC 的甲苯、胞嘧啶和尿嘧啶混合物在 AdvanceBio MS Spent Media 色谱柱上的等度分离。
按照上述方法配制流动相，即配制 200 mmol/L 甲酸铵（或正在使用的其他盐）的储备液，然后分别用水或乙腈将流动相 A 和 B 稀释 10 倍，其原因来自多方面。
通常用于 HILIC 的盐易溶于水，但在乙腈中的溶解度有限，因此将储备液配制为水溶液可最大程度减小溶解问题。
从配制储备液开始，然后小心稀释，确保两种流动相具有相同的离子强度。 我们希望避免在 HILIC 分离中增加离子交换效应。
最后一个原因是简单便捷。 配制一种高浓度盐溶液、过滤并将其储存
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