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今天,YoYo老师带来一期久违的技术科普文章!
液相色谱分析有很多模式,反相、正相、离子交换、HILIC,还有混合模式等等。这次我们就来聊聊亲水相互作用HILIC模式,平时使用HILIC色谱柱的老师应该也不在少数,但是我们可能也没有仔细分析过,溶剂中水的含量对于HILIC模式分离情况的影响。
下面我们以栀子苷和京尼平苷酸在HILIC(亲水性相互作用)模式下的峰型和分离为例来进行说明。
栀子苷是中药山栀子中所含的一种糖苷类物质,具有促进胆汁分泌、引起腹泻的功效。京尼平苷酸则是杜仲里所含糖苷的代表成分,可以延缓或预防由于饮食或生活习惯引起的高胆固醇、高血压、高血脂等常见健康问题。
由于这两种物质都是高极性的糖苷类物质,在疏水性的ODS色谱柱上保留很弱,无法被完全分离,所以需要用到HILIC模式进行分析。使用OSAKA SODA PC HILIC色谱柱在高有机相条件下,能够有效分离这类亲水性化合物。
图1 标准物色谱图
HPLC Conditions :
色谱柱 : PC HILIC S5 ; 2.0 mm i.d. × 250 mm
流动相 : 0.1 vol% CH3COOH, H2O / CH3CN = 10 / 90
流 速 : 200 μL/min
温 度 : 40 ℃
检测器 : UV 254 nm
进样量 : 2 μL
溶 剂 : H2O / CH3CN = 10 / 90
众所周知,HILIC模式的形成,需要在极性固定相表面形成一个富水层,这通常需要使用高比例的有机溶剂作为流动相,一般有机相比例要≥70%,同时有机相比例越高,保留时间将有延长趋势。
但对于极性化合物来说,通常水溶性比较好,那么以水作为溶剂溶解的样品,在HILIC模式下是否会产生溶剂效应的影响呢?我们做了相应比较实验。
在流动相配比相同的情况下,样品溶剂中水的比例不同,可以明显看到对峰形的影响(图2)。
图2 样品溶剂的影响
如上图所示,各峰的峰形随着样品溶剂中水的比例增加而逐渐变宽。由于使用10/90浓度的溶剂和使用流动相(10/90,添加乙酸)作为溶剂的峰形几乎没有区别,因此水的比例不同时对峰型的影响更大。
将两种化合物的理论塔板数和不对称因子对样品中水的比例作图(图3)。虽然有细微的差别,但两者显示了相似的趋势。从这些数据里可以看出,在HILIC模式分析中,溶剂中的水比例和流动相相同或者低于流动相比例时,可以得到更好的峰型和最佳分离效果。因此在使用HILIC模式进行样品分析时,推荐使用流动相作为样品溶剂,以得到最好分析结果。
图3 两者的理论塔板数和不对称因子
PC HILIC 色谱柱
大阪曹達独立研发的两性离子型亲水色谱柱——PC HILIC,键合为PC(磷酸胆碱)基团,它是构成细胞膜的成分,拥有高亲水性和生体适应性。