新春不发福，远离糖尿病！

独在异乡为异客，每逢佳节胖三斤。

一年时间忙忙碌碌地过去，转眼间已转到 2021 年。春节将近，由于新冠病毒仍在肆虐，为防疫工作，今年春节国家开始鼓励就地过年，减少探亲访友，期待疫情早日过去。

但不管在哪里过年，年味不能少，今年新春快递不停、开门的店铺也变多了。大采购结束，春联福字、电子爆竹都已就位，还有香酥鸡、红烧鱼、猪头肉、炸鸡翅、酱肘子、麻辣兔头、糖醋排骨、白灼虾、粉蒸肉、烤全羊、水煮肉片、辣子鸡、油爆虾、八宝饭、炸春卷、小鸡炖蘑菇、北京烤鸭、梅菜扣肉、香辣蟹也要准备好！

虽然需要减少走亲访友，但现在通讯发达，闲时打打电话聊聊天，视频看看彼此，也无需再多加惦念，但会突然发现彼此……

……

虽然为了“美”疯狂减肥、节食并不值得提倡，但体重还是需要控制在健康范围内的，肥胖会导致多种疾病的产生（但仅仅看着微胖并不会！），再加上今年春节除了吃喝不愁之外，居家抗疫也使得大家的运动量有所减少，肥胖+高热量食物+运动量不足，像是家里的父母老人年纪再大一些，很容易被 2 型糖尿病找上门来。

2 型糖尿病原名叫成人发病型糖尿病，患者体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果较差，因此患者体内的胰岛素是一种相对缺乏，部分症状较轻的患者可以使用口服降糖药进行控制。

胰高血糖素样肽 -1（GLP-1） 是回肠内分泌细胞分泌的一种脑肠肽，是一种常见的 2 型糖尿病药物作用的靶点，相关的激动剂可以可抑制胃排空，减少肠蠕动，故有助于控制摄食，减轻体重，对糖尿病患者有降糖和减重双重作用。

但市面上有多种 GLP-1 激动剂类降糖药，大家都说自己的药最好用，应该如何去评价呢？一个比较关键性的指标就是 Kd 值，即解离常数（dissociation constant），反映的是化合物对靶标的亲和力大小，值越小亲和力越强，代表激动剂与受体结合越好。

Cisbio 的 Tag-lite HTRF 平台能够有效地用 HTRF 荧光团标记目标位点上感兴趣的蛋白。细胞表面受体可以插入 SNAP-tag 质粒中，然后用这种结构转染细胞并表达标记的受体。通过添加 snap -lumi4-Tb 底物，用铽（Tb）穴状化合物标记受体。为了进行结合试验，受体的配体用 HTRF 受体荧光团标记，例如 d2。当 d2 配体与铽标记的受体结合时，可以使用具备 HTRF 功能的微孔板读板机检测受体到配体的时间分辨荧光共振能量转移（TRFRET）（图 1）。 

图 1 Tag-lite 细胞表面结合实验示例。GPCR 兴趣基因序列插入到 SNAP-tag 质粒中，然后细胞转染并表达该受体，GPCR 通过添加 snap -lumi4-Tb 底物共价标记一个穴状化合物供体。最后结合实验使用标记配体实现。

Cisbio 提供了多种标签和兴趣蛋白标记编码的质粒，以及已经用这些结构物转染的冷冻细胞。该结构体能够表达标记蛋白，如受体，可以用铽标记，同时其受体配体( 激动剂或拮抗剂 ) 用受体荧光团标记。Tag-lite 平台适用于广泛的应用，如受体二聚化、配体结合分析和第二信使评估。结合动力学可以研究药物 - 蛋白质复合物的结合和解离速率，是优化候选药物体内疗效的必要步骤 1。

Cisbio 的 Tag-lite HTRF 平台能够有效地用 HTRF 荧光团标记目标位点上感兴趣的蛋白。细胞表面受体可以插入 SNAP-tag 质粒中，然后用这种结构转染细胞并表达标记的受体。通过添加 snap -lumi4-Tb 底物，用铽（Tb）穴状化合物标记受体。为了进行结合试验，受体的配体用 HTRF 受体荧光团标记，例如 d2。当 d2 配体与铽标记的受体结合时，可以使用具备 HTRF 功能的微孔板读板机检测受体到配体的时间分辨荧光共振能量转移（TRFRET） （图 1）。

优势

提供可靠的，免洗的饱和结合实验

Cisbio HTRF 平台提供多种配置实验和试剂的选项

已有经过认证的 HTRF 仪器，确保仪器性能 

胰高血糖素样肽 -1 受体 (GLP1R) 在胰腺细胞中表达，其激活刺激腺苷酸环化酶途径，导致胰岛素合成和释放增加。因此，GLP1R 被认为是治疗糖尿病的一个潜在靶点 2。GLP1R 也在大脑中表达，它参与控制食欲，并在记忆和学习机制中具有潜在的重要作用。

在这里，我们为大家展示如何使用 SpectraMax®i3x 和 SpectraMax®iD5 多功能微孔 板读板机使用 HTRF 进行可靠的、免洗饱和结合分析。使用 Tag-lite 技术在 HTRF 认证的 SpectraMax i3x 和 iD5 读板机上评估 GLP1R 配体的结合。

饱和结合实验

配体结合实验是评估特定配体与受体亲和力的重要手段，也是理解受体和配体相互作用机制的关键。结合研究因 此成为药物发现过程的一部分，有助于设计出高选择性 和特异性结合靶标药物。结合活性决定了单个生物分子之间的结合作用，如受体及其配体 ( 如激动剂 )。它通常用饱和分析来检测，用平衡解离常数（Kd）来表示。Kd 用于评估配体与其靶标之间的相互作用强度并对其作用强弱程度进行排序。Kd 值越小，配体与靶标的结合亲和力越大。在竞争或抑制研究中，选择合适的配体浓度是准确测定 IC50 和抑制常数 （Ki）的必要条件。

一般来说， 浓度达到或略低于 Kd 值是可以接受的。使用高于 Kd 值的配体浓度会使药物看起来不如它们在体内的效力。饱和结合试验检测总结合和非特异性结合浓度增加的配 体 ( 图 2 )。荧光配体滴定到含有固定数量标记细胞的溶液中，孵育至平衡。当荧光配体与受体结合时，TR-FRET 发生，并通过 HTRF 认证的微孔板读板机进行检测。得到的 HTRF 比率代表总结合。非特异性结合方式作为阴 性对照，其使用未标记的配体进行检测，说明已标记的配体与受体、非受体分子或微板的非特异性结合 2。

图 2 Tag-lite 饱和结合实验。总结和检测通过荧光配体与受体的结合出现的 TR-FRET 测定。非特异性结合检测是通过过量的非标记 的配体与荧光标记的配体竞争结合标记的 GPCR，未标记的配体结合至受体上 TR-FRET 不会发生。

检测时，将荧光标记的配体滴定到含有固定数量标记细 胞和 100 倍摩尔浓度的未标记配体的溶液中。标记的和未标记的配体竞争与标记的 GPCR 结合。由于非特异性配体过多，它会与受体结合，所以不会发生 TR-FRET。从这种滴定法得到的 HTRF 比率代表非特异性结合。通过从每个荧光标记配体浓度的总结合减去非特异性结合来计算特异性结合。

材料

Tag-lite GLP1R 表达，Tb 标记的冷冻细胞 （Cisbio cat.  #C1TT1GLP1）

Tag-lite 缓冲液（Cisbio cat. #LABMED） 

GLP1 受体红色激动剂 (Cisbio cat. #L0030red)

毒晰外泌肽 4（Exendin 4，Sigma-Aldrich cat.# 1269105）

白色，低体积 384 孔微孔板（Greiner cat. #784075）

带有 HTRF 检测卡盒（Molecular Devices cat. #0200- 7011）的 SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机（Molecular Devices cat. #i3x）

带有 HTRF 检测系统（Molecular Devices cat. #6590- 0144, 包含增强型 TRF 模块及 HTRF 滤光片）

方法细胞

根据产品说明准备细胞，冷冻的细胞在 37℃ 解冻，转移到含有 5 ml 1x Tag-lite 缓冲液（TLB）的试管中。4℃， 1200g，离心 5 min。吸出上清液，重悬于 2.7 ml 的 1x  TLB 中。

荧光标记配体

GLP1 受体红色激动剂是一种用红色荧光 HTRF 探针标记的 Exendin 4 衍生物。将原浆浓度稀释于 1X TLB 中制备 400 nM 浓度的红色激动剂（原浆浓度见试剂盒说明书）。10 个额外的 1:2 稀释，然后用 1X TLB 得到最终浓度从 100 nM 到 0.097 nM。

非标记配体

稀释原溶液到 1 x TLB ( 见产品说明 ) 制备 40µM 终浓度无标记 Exendin 4 配体。这相当于最大标记配体浓度 400 nM 的 100 倍摩尔。

实验板设置

按照 Cisbio 配体结合说明书将试剂分配到板内 ( 图 3 )。384 孔白板孔内注入 10 µL GLP1 受体细胞，5 µL TLB 添加至总结和孔内，5 µL 未标记配体添加至非特异性结合孔中。最终，5 µL GLP1 受体激动剂 exendin 4- 红色标记物添加到所有孔中。将实验板在室温孵育 2h 并用优化的仪器设置（表 1）在 SpectraMax i3x 和 iD5 读板机上读取。两个读板机都进行高度优化以确保最佳的实验灵敏度和动态范围。

图 3  384 孔低体积微孔板实验设置。实验板在室温孵育 2 h 后，在 SpectraMax i3x 和 iD5 读板机上检测 TR-FRET ( 见表 1 的仪器设置）

表 1 i3x 和 iD5 的仪器设置

数据分析

HTRF 分析涉及 Cisbio 的专利比率法，该方法基于检测到的两个发射波长。616 nm 处的供体发射光被用作内参，而 665 nm 处的受体发射光被用作测定生物反应 ( 结 合 ) 的指示剂。这种比率测量 ( 受体与供体荧光的比率 ) 减少了孔间的变异，并消除了化合物干扰。在下面的步骤 4 中计算的 Delta F，将信号去除背景，对于测定之间的 比较是有用的。根据 665 nm / 616 nm 的比值计算结果， 用 Delta F 表示如下 :

数据通过 SoftMax® Pro 软件获取并分析，软件内已预置 了 HTRF 的模板可以简要的检测和分析。

结果

对总结合孔和非特异性结合孔的每个标记配体浓度计 算 HTRF 比率。通过从每个荧光配体浓度下的总结合减 去非特异性结合计算特异性结合。如上文所述，对数据进行分析，并使用 SoftMax Pro 软件进行双直角双曲线拟合（图 4），得出最佳结果，读数设置如表 1 所示。SpectraMax i3x 读板机产生的饱和曲线 ( 这里没有显示 ) 与 SpectraMax iD5 读板机类似。在特定饱和曲线中双直角双曲线拟合中拟合参数 B 为 Kd。Cisbio 建立了一个 5  nM 或更低的 Kd 值，以确认酶标仪能够成功地测量带有红色受体的 Tag-lite 分析。SpectraMax i3x 读板机的 kd 值为 0.816 nM, SpectraMax iD5 读板机的 kd 值为 2.347  nM ( 表 2 )，证实了这两种仪器检测这些 Tag-lite 实验的能力。

图 4 在 SpectraMax iD5 读板机上检测饱和结合曲线。饱和结合实验对增加的配体浓度达到平衡时检测总结和与非特异。特异性结合 的比率 ( 蓝色曲线 ) 为总结合率 ( 红色曲线 ) 减去各浓度下非特异性结合率 ( 绿色曲线 ) 的比值。

表 2 Tag-lite 结合饱和曲线的结果总结

……

虽然现在控制血糖的药物和手段很多，相比过去糖尿病对病人生活质量的影响也在逐渐降低，但生病仍旧不是好事，并且 2 型糖尿病属于终身疾病，现在医学界并没有很好的治愈办法，所以还是建议大家管住嘴、迈开腿，减少患病率呀！

提前给大家拜个早年，

新年到，

福运到，

血糖不能高！

（三押√！）

参考文献：

1. http://www.htrf.com/htrf-technology

2.http://learn.cisbio.com/hubfs/cisbio-ls/docs/application-notes/Determination%20of%20association%20(kon)%20and%20dissociation%20(koff)%20rates%20constants%20using%20the%20Tag-lite%20platform.pdf?hsCtaTracking=10f4759a-f255-4f21-aa95b03c24b839e9%7C736c51a4-4301-4256-ab76-a10df00e9593https://cisbio.wistia.com/medias/i2eup2dah5

3 . https://fr.cisbio.eu/media/asset/c/i/cisbio_dd_pi_c1tt1glp1.pdf

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