两种常见高内涵细胞成像实验过程展示

开工

大吉

春节后开工后的第一个星期五，为了唤醒一下爽了一个春节的大脑，我们来说点比较基础的实验吧～

比如——

活细胞成像？

活细胞实验作为一种科研界已广泛使用多年，细胞生物学领域的常规实验，它可广泛应用于细胞生物学研究的各个领域。相对于经常使用的终点法，固定细胞染色实验，活细胞实验更能体现细胞在正常生理条件下的反应，而且细胞对于化合物或其他外界刺激的反应往往是动态的，而这种动态变化使用传统固定细胞染色的方式经常会导致错误或误导性的结果，所以在正常培养条件下（37 摄氏度，5% 二氧化碳）进行动态细胞分析是十分必要的。

本文介绍几种使用具备活细胞动态成像分析功能的高内涵（High Content）系统进行细胞样品拍摄分析的具体案例，同时也会提供高内涵常规操作的演示视频，希望能帮助大家更快得到优秀的实验结果。

加湿水槽，气体管路，温度控制等活细胞培养功能模块已经是当前高内涵系统的常见功能：

自 20 世纪 60 年代发现绿色荧光蛋白以来，各种荧光蛋白（FP）及其变体已被开发出来，跨越整个可见光谱。这些基因编码的荧光蛋白在细胞生物学领域引发了一场革命。荧光蛋白技术和自动显微镜技术的发展使研究人员能够更深入地研究活细胞中的基因功能和动态过程。荧光蛋白常被用作融合到感兴趣基因上的报告基因。一旦 FP 标记的基因产物被细胞成功表达，就可以对其进行成像，以研究蛋白质、细胞器和细胞间隔的功能并跟踪其定位。

高内涵活细胞实验实例 1

活细胞细胞核染色，转导效率分析：

添加 CellLight Nucleus-CFP, BacMam 19 小时后 HeLa 细胞的代表性 10X 图像：

被转导的 HeLa 细胞明场和 CFP 可以被清晰地观察到，右侧为高内涵 CellReporterXpress® 软件分析后的图例展示，绿色为阳性细胞红色为阴性细胞，可见不同 PPC 浓度下，转导效率略有区别。通过高内涵软件的自动定量分析，得到结果如下：

可见，BacMam 试剂有效地转导了 HeLa 和 U2OS 细胞，并为活细胞成像应用提供了一个更常用合适的核染色替代试剂。可替代 Hoechst，DAPI 等对细胞正常增值有影响的荧光染料。

U2OS 细胞进行多重染色：AlexaFluor 546 Phalloidin 染色细胞骨架（黄色），MitoTracker Deep Red 染色线粒体（红色），BacMam Nucleus- CFP 染色的细胞核（蓝色）：

显示转导方式的细胞核染色兼容多重荧光染色。

高内涵活细胞实验实例 2

活细胞评价细胞周期抑制剂：

监测对细胞周期变化的影响对于肿瘤的发展及药物研发有着重要的作用。例如，已知抑制有丝分裂的化合物大都用来减缓肿瘤细胞的生长。活细胞高内涵的筛选已被验证可以区分细胞的每个周期。监测对细胞周期变化的影响对于肿瘤的发展及药物研发有着重要的作用。例如，已知抑制有丝分裂的化合物大都用来减缓肿瘤细胞的生长。活细胞高内涵的筛选已被验证可以区分细胞的每个周期。

FUCCI 细胞周期标记物标记后与细胞周期变化关系。表达 Cdt1-RFP 红色为 G1 期，表达 Geminin-GFP 绿色为 G2/M 期，同时表达 Cdt1-RFP 红色和 Geminin-GFP 绿色的为 S 期：

 实验过程：

● 准备细胞悬液，40,000 细胞 /mL 的 Hela 细胞悬液与 30 颗粒/细胞浓度的 FUCCI 试剂混合，以 4,000 细胞/孔的浓度种在 96 孔板中，孔板置于 37°C，5 % CO2 的环境下贴壁 8 小时。

● 不同浓度的有丝分裂抑制剂处理细胞，然后孔板放入 ImageXpress Micro 系统。

● 每隔 2-3 小时系统自动拍摄一次图片，使用 20 倍 Plan Apo 物镜，同时获取明场及两个荧光通道 FITC 和 TRITC 的图像。实验持续 48-72 小时，细胞可完成 1-2 次分裂。

● 分析延迟实验图像使用高内涵成像与分析软件的用户自定义模块。

图像和软件分析 Segmentation：

活细胞使用 FUCCI 细胞周期指示剂，化合物处理后细胞周期的变化可以被实时监测到，比终点法检测固定细胞能得到更多的信息。转染了 FUCCI 细胞周期指示剂的 Hela 细胞在高内涵细胞中实时拍摄了图像，并通过 MetaXpress® 高内涵成像与分析软件的模块进行分析，明场下识别出所有细胞，基于荧光蛋白表达区分出不同周期。表达红色为 G1 期，表达绿色为 G2/M 期，同时表达红色和绿色的为 S 期。处于 G0 期的细胞没有荧光信号，但是会在明场下被识别到并计入细胞总数中。

通过高内涵软件自动分析并导出的数据可见：细胞周期抑制剂可引起细胞停滞在特定周期经过 24 小时化合物处理，经过 48 小时的动态连续拍摄和分析，可见大部分细胞停留在 G0 期，只有少数细胞表达了细胞周期标记蛋白。紫杉醇和诺考达唑处理的细胞有一定的细胞停滞在 G2/M 期：

总之，通过以上两个常见活细胞实验我们可以发现，

通过转染，转导等方式表达各种荧光蛋白来实现多种活细胞标记是活细胞实验的常见方法。

使用高内涵或其他自动化成像系统不仅能以自动化代替科研工作者劳动，也能提供大量图像定量数据，更准确的揭示活细胞的变化。

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