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前言
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本文的内容是由ACD/Labs中国区的技术专家葛师成根据ACD/Labs的核磁产品经理Dimitris Argyropoulos的最近的Webinar题目：“What''s in my NMR Tube PartII”进行的内容翻译和转述。从事NMR专业的研究人员及其领导都应当看一下这篇文章。在编写文章时，采取的形式类似于对PPT的内容和注释，请读者联系图片与内容进行了解和思考。此次内容的核心是ACD/Labs的核磁产品线中最顶级的CASE(计算机辅助结构解析)工具，符合面临困难度最高的结构解析工作的人员的学习需求。面临全未知的结构，如果借助工具来做到事半功倍，请观看下文。
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正文
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这是每个NMR专家都需要回答的问题，但是问题的答案有时候并不是那么简单直接。有时候需要一些工具来辅助决策。
通常这样的问题（结构解析验证问题）大体可以分成以下4个情形：
“我非常确定我的核磁管是什么”，那就需要一个高效率的结构验证工具回答这样的问题。
“我并不是太确定我的东西是什么，但是大致知道是什么东西”，这个时候结构验证的工具还是能很好地帮助回答这样的问题。
“我不知道里面有什么，但是这个物质可能不是什么新的物质”。比如做反向工程，分析样品来自于竞争对手，样品里的组分可能不是什么新的物质，但想知道竞争对手产品里究竟是什么成分，此时已知物检索（Known Structures Search）工具就能很好地解决这样的问题。
“我不知道里面是什么，样品我刚刚分离出来的”，有可能样品来源是新的天然产物，也有可能来源是药物研发过程中从未出现过的杂质。这时候结构解析工具（Structure Elucidator）就是一个很好的选择。
在之前的讲座中已经讲过了前面的3种情形，所以这次讲座的内容主要针对第四种情形，如何使用计算机辅助结构解析工具（CASE）解决结构解析的问题。
计算机辅助结构解析工具(CASE)最早出现于1968年，距今已有50多年，俄罗斯人MiKhail Elysashberg 和Lev Gribov最先想到使用计算机手段从IR的谱图出发解析化合物结构。在过去的50多年中，CASE技术有了日新月异的革新。
CASE作为一种新兴的技术已经成功解决了1000多个结构解析的问题，在多个期刊杂志上发表了100多篇相关论文。另外在过去的一些年也相继出版了一些关于CASE技术的书籍。
这是一些使用CASE技术解析出来物质的结构，其中不乏有一些对人工解析来说非常困难的大结构。
为什么需要CASE技术，为什么有些结构人工解析非常困难？得从分子式大小以及其同分异构的数目上来回答这个问题。从左边的列表中可以发现，如果分子式中有6-7个C原子，它的同分异构体数目还不算多（<10），8-9个C原子时也不算太多，但如果分子式中的C原子个数达到30个C原子，就存在41亿个同分异构体，有40个C原子的时候同分异构体的数目将是一个很大很大数字，这还是分子式中仅存在C和H原子。如果在分子式上加上一些杂原子，情况将大大不同，比如，分子式中仅有C和H原子且C原子的个数为15时，同分异构体的数目为4300多个，但是如果加上两个O原子，同分异构体数目将达到1381亿个。所以这对人工解析结构来讲是非常大的一个挑战，人无法全面考察到如此多数目的同分异构体，这就意味着很有可能错过了正确结构。
通常核磁结构解析的工作流程如下：首先需要采集样品的高分辨质谱，由高分辨质谱得到化合物的分子式。接着采集样品的一维，二维谱图，使用一维谱图做排重的工作，排除已知的化合物，确保化合物结构新颖性——以前没有被发现过。接下来才是真正的结构解析工作，最后一步则是确定化合物的3D构型。
为什么分子式对结构解析很重要？化合物分子式是解析结构的基础，如果不知道化合物C，H，O，N……原子的个数，是没有办法解析此化合物的结构的。在大多数情况下化合物的分子式是由高分辨质谱获得，也有少数情况下低分辩质谱也可以获得化合物分子组成信息，但是需要其它谱图（IR，UV-Vis）的辅助，可以由辅助谱图获知样品中含有哪些特定的官能团，比如发现化合物中含由羰基，那说明此化合物结构中含有O原子。
下一步需要决定采集化合物的哪些NMR谱图，一般情况下谱图的最低要求是一维H谱，二维HSQC HMBC谱，COSY谱虽然不是至关重要的，但是最好也能采集。一般情况下由HHSQC HMBC可以看到样品的H，C信号，但如果在仅有HHSQC HMBC谱的情况下有些C的信号看不到，则需要进一步采集样品的C谱。如果是严重缺氢样品，则需要采集H2BC和LR-HSQMBC，LR-HSQMBC最多可以看到6-7键的耦合信号。如果样品是含15N的样品，则可采集15N相关谱图HSQC HMBC，这些谱图不但可以缩短结构解析时间，还可以减少结构的可能性。如果样品量较大，且仪器分辨率高，可以采集ADEQUEATE或INADEQUATE谱图，如果能有这两种谱图，则可以大大降低结构解析难度。
下一步就是排重，排重可以有效避免重复解析工作，因为有些化合物结构可能是已知的，可以使用C谱检索实验C谱数据库的方式来进行排重。ACD/Structure Elucidator软件包含了PubChem内所有化合物的预测谱图数据库，可以用来进行谱图排重，具体检索排重方法在之前的讲座I中已经涉及过，这里不作展开介绍。
到这里已经知道了化合物的分子式，也知道化合物为新结构。接下来的工作就是使用计算机辅助结构解析解析化合物结构，其具体工作流程如下。首先需要将实验谱图的信号进行标峰，这一步是第一步也最重要的一步，必须确保标记的信号为有效信号，完成谱图标峰后，软件会自动根据信号生产分子连接图（MCD）， MCD图中会表明结构中有哪些原子，它们是怎样连接的。 输入化合物分子式后就可以让软件开始生成候选结构列表，生成的结构列表中的结构可能会有很多，所以需要对结构列表进行排序以便找到正确结构。对结构排序的具体方法是，软件预测所有结构的H C 谱图再跟实验谱图进行比对计算偏差，预测谱图与实验谱图最接近的结构就是最佳结构。所以一个好的预测工具显得尤为重要，因为如果预测不准确就不可能顺利地找到最佳结构。
虽说上面的工作流程看起来不是太复杂，但是也存在一些挑战。通常对计算机辅助结构解析来讲有以下六种挑战。首先第一个挑战是“谱图不正确”，所谓“谱图不正确”指的是在做信号标峰的时候标记了不正确的信号，有可能标记出了一些假信号，这需要NMR专家仔细查看谱图信号辨认信号的真伪。第二个挑战是“浮动原子”，所谓“浮动原子”是指在MCD图中可能存在某些原子不跟其它原子有任何连接，解决这样的问题就需要采集更多的谱图，如果没有办法再采集谱图了，这也不意味着没有办法进行结构解析，只是在软件在计算结构的时候，可能会考察更多的结构花费更长的时间，但是如果是第一个问题给了错误的谱图信号，那就不能正确地解析出最终结构了。第三个挑战是谱图存在“不正常”的相关信号，所谓“不正常”信号是指跟预期不太相符的相关信号，比如通常HMBC谱图中H C信号为2，3键信号，但是谱图中出现了4，5，6键相关信号，再比如COSY谱图中H通常相隔1，2个键，但是谱图中出现了3键信号，如果能注意到并区分这些信号那是更好，如果不能也并不意味着不能进行下一步的工作，软件中含有“模糊”生成结构功能，如果软件根据标准信号规则不能生成结构，软件会自动扩展信号关联范围直到产生一些结构。第四个可能的问题是“信号不确定”，“信号不确定”是指由于分辨率问题，如HMBC信号中两个C很近有时候不能确切指认H是与哪个C相关。最直接的解决方法是采集局部谱图或提供更高分辨率的谱图，当然如果没有更高分辨率的谱图也不是不能处理这样的问题，软件会自动考虑模糊信号的所有可能性，扩大结构排列范围。第五个挑战是对称性结构问题，谱图只能看到结构的一半信号，比如分子式有40个C，但只能看到20个C的信号。对于这样的对称结构，软件需要有特殊的算法，ACD软件非常擅长处理这样的问题。最后一个挑战是有些结构排序的结果非常接近，不能很好地区分哪个是最终正确结构，这样的问题有两种解决方式，一种是使用DP4算法排序，另一种是使用DFT算法重新预测化学位移。
解析出二维平面结构并意味着解析工作全部完成，下一步的工作还需要确定其3D构型。比如这个结构存在11个手性中心，这就存在2048个可能的立体手性异构体，哪一个才是最终真正的结构？
可以采集NOSEY/ROESY谱图解决这样的问题。NOSEY/ROESY谱图可以提供原子间相互距离的信息，通常来讲如果在NOSEY/ROESY谱图中看到相关信号，这说明这两原子间距离小于5A，且相关信号的强弱与距离远近成正比。NOSEY/ROESY谱图可以是二维也可以是一维谱图，可以用于结构较小，手性中心比较少的刚性分子的手性确定，而对于复杂结构则需要考察谱图信号的积分值。
软件确认手性立体异构的流程，首先生成立体异构体，在NOSEY/ROESY谱图中标记相关信号，根据标准距离校正NOSEY/ROESY谱图信号，几何最小化立体异构体找出能量最小的构象异构体计算原子空间距离，比对NOSEY/ROESY谱图信号，计算原子空间距离的预测值与实验值的偏差从而确认最有可能的立体异构体。
总而言之，如果不知道核磁管里有什么，其实有很多的方法可以解决这样的问题。计算机辅助结构解析工具在过去一些年中有了长足的进步，可以完整地解决未知物的2D，3D结构解析工作。高质量的数据对结构解析来说很重要，但是如果样品量较少没有办法采集高质量的谱图，也有其它方法比如CASE技术能有效解决结构解析问题。
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评论
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作为世界上第一个将CASE实现并有可能在当前仍然是唯一能够完成真正的CASE工作的软件公司，ACD/Labs在国内有相当多的有从头结构解析需求的客户。客户群体既包括高校的天然产物研究的实验室，也包括制药公司和合同外包研究公司。无论在哪个领域，我们都有非常成功的案例故事可以分享。
——ACD/Labs 阎作伟
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