一文了解定量核磁（YYDS）附验证结果

• DMSO-d6 (CIL #DLM-10, Lot PR-M1486) was used in all solutions (except for the capillary solution used in stability study)

• Benzoic acid (NIST, SRM 350b) (certified purity of 99.9978%)

• 3,5-Dinitrobenzoic acid (TraceCERT®, Sigma #15639, Lot BCBH8381)

• L-Carnitine•HCl (methyl-d3) (CIL # CLM-DLM-1871, Lot PR-23573)

• O-Palmitoyl-L-carnitine•HCl (methyl-d3) (CIL # DLM-1263, Lot PR-19948)

• Carbon tetrachloride (Sigma-Aldrich # 289116, Lot # 02244TD)

• 2,2,4,4-Tetramethyl-3-pentanone (Aldrich # 282618, Lot # BCBD9401V) (for stability)

• 528 PP Wilmad 5 mm NMR tubes

• Sartorius micro balance (Model NE365) (for weighing the carnitines)

• Sartorius analytical balance (Model P225D) (for weighing all compounds and DMSO-d6)

不确定度计算参考:EURACHEM CITAC指南CG 4，“定量分析测量中的不确定度，”第三版，QUAM:2012

步骤1: 计算解的总权重和相关不确定性:

苯甲酸溶液的总质量，ms及相关不确定度，√ms，单位为g/g

苯甲酸标准参比溶液(CIL # DLM-9422)的850 MHz 1H-NMR谱。给出了苯甲酸、HOD和DMSO-d5的芳香族质子共振。苯甲酸(~12- 13ppm)的酸性质子共振没有显示↓

苯甲酸标准参比溶液850 MHz 1H-NMR谱的垂直扩展。1 ~ 2ppm的杂质峰面积占苯甲酸芳香族质子信号峰面积的<0.05%↓

DMSO-d6中3,5-二硝基苯甲酸850 MHz 1H-NMR谱的垂直扩展。苯甲酸芳香族质子共振的区域如图所示↓

      通过使用可溯源至NIST的校准砝码集和可溯源至NIST校准证书的实验室天平，保持对SI的可溯源性。保持一个完整的千克校准链。在计算中使用了制造商指定的重复性值。参见指南CG-4，第三版，第28、38和127页。

       标准液重量m(皮重)(g): 100.863 m(毛)，(g): 219.064

      二级标准原液的重量(ms)由m(毛重)减去m(皮重)计算。根据EURACHEM CITAC Guide CG 4计算二次标准溶液重量(ums)的不确定度。(对称量不确定性的贡献计算两次，一次为皮重，一次为毛重。每一个都是独立的观察。)

       步骤2: 苯甲酸溶液质量分数的计算

苯甲酸溶液质量分数，mb及相关不确定度，用mg/g表示

       苯甲酸在溶液中的浓度(mb)是用苯甲酸的质量分数修正重量除以溶液的总重量来计算的。不确定度计算包含适当的重量和质量分数不确定度。

苯甲酸结晶&苯甲酸，溶液质量分数：

标准制剂浓度:12.558 mg/g +/-0.0008 mg/g (K = 2)

以3,5-二硝基苯甲酸(DNBA)为qNMR内标，验证参比溶液中苯甲酸浓度

过程:

步骤1：将174 mg DNBA转移到脱皮的10 mL容量瓶中，质量记录为接近0.01 mg。

步骤2：将苯甲酸DMSO-d6溶液加入到磨砂瓶中，记录质量为0.01 mg。

步骤3：在完全溶解和混合后，共测量了10次1H-NMR谱。

步骤4：用芳香族化合物的积分法计算了参考溶液中苯甲酸的浓度质子在DNBA和苯甲酸上。

Steps 1 and 2  

Steps 3 and 4

苯甲酸标准参比溶液中3,5二硝基苯甲酸300 MHz 1H-NMR谱的选定区域。给出了计算苯甲酸化学纯度的积分公式。值指T1值(以秒为单位)↓

苯甲酸浓度的计算

测定苯甲酸的毫摩尔= (BA的积分/5)(mg DNBA) / (DNBA的积分/3)(MW DNBA)

制备浓度的界限(k = 2)位于测量值的界限内。用TraceCert二硝基苯甲酸和qNMR测定的苯甲酸浓度与制备的苯甲酸浓度无统计学差异。

苯甲酸标准参比溶液试验方法验证: l-肉碱(甲基-d3)化学纯度测定。

      在苯甲酸标准参比溶液中制备了8种含有不断增加的l-肉碱(甲基-d3)的溶液。每一种溶液分别获得三个连续的1H qNMR谱。

     由两名分析人员在两天内对该方法的中间精密度进行了调查。每位分析师根据FusionAE软件(S-Matrix Corp. Eureka, CA)生成的设计，准备100%水平的l-肉碱(甲基-d3)溶液。由于篇幅所限，本文没有给出o -棕榈酰-左旋肉碱的验证结果。

DMSO-d6中l-肉碱(甲基-d3)的300 MHz 1H-NMR谱

l-肉碱(甲基-d3)苯甲酸标准参比溶液的300 MHz 1H-NMR谱

左卡尼汀(NMe-d3)：HCl NMR 浓度响应

左卡尼汀(NMe-d3)：HCl NMR验证结果：

l -肉碱(NMe-D3)•HCl的其他分析数据

       CIL为qNMR提供外部校准标准品。该标准使用CIL的高质量DMSO-d6和NIST的苯甲酸(SRM 350(b))制定，苯甲酸是酸度测定的标准参考物质。5mmol和15mmol苯甲酸浓度可用。利用计量技术准确测定了苯甲酸的浓度和相关的扩展不确定度，并用qNMR进行了验证。DMSO-d6中苯甲酸的1H-NMR谱如图1所示。

       CIL目前在预密封核磁共振管中提供。有关核磁共振管和填充体积的详细信息，请参阅下面的信息。其他核磁共振管和浓度可根据要求提供。

      内参法的误差通常小于1%，被认为是获得定量1H-NMR谱的最准确和可重复性的方法。不幸的是，参考标准通常会被考虑到每个样本溶液中，这需要时间和精力，并且已经报告了该方法的最大错误来源。

       CIL提供一种含已知苯甲酸量的DMSO-d6溶液，供内部参考。由于该溶液是预先配制的，用户不需要称量标准材料。消除这一步骤将减少样品制备的工作量和时间，也可能带来比用户执行该配方更准确的结果。要使用该产品，样品必须可溶于DMSO-d6，对苯甲酸具有物理和化学惰性，在酸性ph中稳定。理想情况下，样品在苯甲酸芳香烃质子(7.4-8.1 ppm)、HOD (~ 3ppm，但变化不定)和DMSO-d5 (2.5 ppm)区域内不会产生共振。在分析证明上给出了苯甲酸浓度及其不确定度。

      CIL用于制定qNMR外部校准参考标准散装溶液的程序允许确定校准标准(例如苯甲酸)浓度的扩大不确定度。通过使用可溯源至NIST的校准重量集和可溯源至NIST校准证书的实验室天平，维持对SI的可溯源性，保持对千克的校准链不间断。造成苯甲酸浓度1不确定性的因素如下。

qNMR标准配方中苯甲酸浓度不确定因素的因果关系图↑