3D 细胞球，从培养到分析

根据 3D 细胞培养中细胞生长情况，分为两种方法，基于 Scaffffold 基质胶的（SCAFFOLD-BASED）3D 细胞培养法和无基质（SCAFFOLD-FREE）的 3D 细胞培养。

基质是 3D 细胞培养的重要成分，根据不同的培养条件和目的，选择不同的基质。

基质为细胞培养中的细胞提供支撑。细胞能够增殖并迁移进入基质网络内部，最终粘附到基质上。当细胞生长时，成熟细胞相互影响，并最终形成接近于细胞来源组织的微型结构。在大部分情况下，这些细胞会表现为尺寸各异的球形，称为细胞球：这些细胞结构通常用于药物筛选、评价或者其他 3D 细胞的应用。

通常，有基质支撑的 3D 细胞培养方法获得的细胞球，由于基质提供了较大的接触面积，其大小会比没有基质支撑的方法获得的细胞球更大。

根据培养的细胞类型的不同，基质蛋白纤维的特性和形状应与之相配合。基质蛋白纤维的布局应与模拟的器官结构相符，具有类似的结构、尺度和功能。然而，基质纤维越大、结构越复杂，就越难以提取。另外，为了防止任何可能出现的障碍（免疫反应、纤维化、影响生长），无论采用何种类型的基质，所采用的基质都必须为细胞生长提供支撑，并具有生物相容性。基质可以是水凝胶，薄膜（或者管状），和 3D 基质结构。

凝胶具有很好的力学特征，是最常用的基质。它具有类似于组织的刚性，在某种程度上能够很好地模拟细胞外基质的作用。事实上，就像其他的基质，凝胶这种空洞结构就像一个能够保持营养物质和可溶性因子（如细胞因子、生长因子）的细胞外基质，这些可溶性因子由细胞产生，在凝胶种扩散，使细胞通过非直接接触的方式进行通讯联系。通过这种方法，非常适合于进行微型细胞实体组织的模拟，并在此基础上进行药物的毒性检测和评价等。

包含大量水和天然生物分子（藻酸盐、明胶、透明质酸、琼脂糖、层粘连蛋白、纤维蛋白）都可作为基质。但是其凝胶化基质比较复杂，会使制备和操作非常困难。

合成的和天然的生物聚合物也可作为 3D 培养的凝胶。根据实验条件和最终目的，可找到多种不同的聚合物，包括惰性的和可生物降解的。聚合物易于操作，更适合于构建基质。

其他类型基质：除了水凝胶外，还有很多基质材料可用。非凝胶聚合材料基质常用于组织工程，不同的材料都需要符合所要模拟器官的机械和物理学特征。

要形成细胞球，细胞团块即可作为一种很好的生理模块而无需依赖于固体物质的支持。这样获得的细胞球通常比较小，也相对松散。最主要的 scaffold-free 3D 细胞培养法就是 forced-floating（强制浮动法），hanging drop（悬滴法）和 agitation based （搅动法）。

forced-floating（强制浮动法）是用超低粘附的聚合物包被的多孔板来进行。通过向孔内加入细胞悬液后进行离心获得。

悬滴法是通过将含有细胞的液滴处理，使细胞聚集为紧凑的均一的细胞球。

agitation based（搅动法）使用生物反应器获得三维的细胞球结构。

forced-floating（强制浮动法）使用简单，并且适合于批量获得，应用广泛。目前市场上有多种不同的产品能够通过该方法，简便快速地获得 3D 细胞球。

均一化细胞球是采用如 Cell-able Oncology 多孔板获得的细胞球。该板采用光刻技术，在多孔板表面光刻获得一致大小的空洞，悬浮细胞可粘附于这些孔内生长成球。

这种方法获得的细胞球大小尺寸均一，一致性好。同时，每个孔内有多个微孔，形成多个细胞球，能够一次获得大量细胞球的结果（相当于重复），适合于大通量、规模化检测。

将细胞悬液加入到超低粘附的 U 型底多孔板内，经过静置培养 2-4 天即可形成形状大小规则均一的细胞球结构。

这种方法操作简便，而且易于放大，耗材便宜，方便进行不同药物的处理，非常适合于药物的毒性评价和药效筛选。

GravityTRAP 法是利用该耗材的特殊设计，其形式类似于多孔板，但是其底部是一个面积极其限制的一种耗材。该法类似于液滴法，能够获得形态均一的细胞球。但是只适用于部分类型的细胞（见后表）。

但是该法的操作不太方便（手动加细胞悬液）、耗材相对较贵，也一定程度限制了其在药物筛选和评价中的作用。

GravityPlus 是一种采用悬滴法获得细胞球，将细胞悬液注入孔内，由于液体表面张力，会在孔下方形成倒垂液滴，液滴内细胞由于重力作用逐渐形成细胞球。

我们比较了以上不同方法的特点和应用范围：

采用响应的重力悬滴多孔板，采用常规的液滴法即可获得均一的细胞球。

根据 3D 细胞球检测的目的的不同，采用不同的成像方法，以此来高效便利地达到实验目的。

采用高内涵进行 3D 细胞球的透射光成像是一种常用手段。通过透射光的成像，可以从整体上观察细胞球的形态和大小，可以方便地进行细胞凋亡、生长抑制等方法的检测。借助高内涵的图像分析功能，能够非常简便地实现细胞球的识别、细胞球大小的测定以及细胞球细胞数量的评判。

ImageXpress Micro 高内涵系统，HCT116 细胞以不同密度种植获得细胞球（A），细胞球的放大图片以及高内涵软件的细胞球识别结果（B）。可见，对于 DU145 细胞，其相应细胞密度与细胞球宽度关系接近理论值。

利用宽场荧光成像技术，能够利用各种荧光试剂盒，实现细胞球内细胞凋亡的准确测量和评判，并能够通过抗体标记技术准确测量细胞内的表达。对于宽场荧光成像，由于焦平面图像受到非焦平面的荧光干扰，通常无法获得准确的细胞数量（仅能通过荧光阳性的面积大小进行近似计算）。另外对于不同 Z 层面的细胞也缺乏分辨能力，造成结果有时有较大偏差。

可同时将宽场荧光成像技术和透射光成像技术结合，从而同时实现以上的功能。

ImageXpress Micro 高内涵系统获得的不同药物处理下的细胞球改变。蓝色：细胞核。绿色：活细胞。黄色：死细胞。

采用具有共聚焦功能的高内涵系统，不但能够获得更清晰的细胞球图像，同时还能够获得细胞球内部的图像。通过共聚焦成像，能够获得细胞球内任意层面的图像，可获得非常准确的细胞定量信息，包括细胞数量、细胞凋亡、蛋白表达、蛋白分布等，而不像宽场荧光成像和透射光成像，仅能获得细胞球整体信息。

3D 细胞球技术是一种用于生物学研究、药物筛选和药物评价的非常有潜力的技术。由于其能够通量化和规模化，除了新的相关技术用于肿瘤治疗研究外，大部分用于药物的筛选和评价。

而对于药物的筛选和评价，通过量化不同干预 / 药物下的细胞球的变化（形态学和功能）都对于药物研究有着重要意义，高准确度、无偏移地对细胞球和细胞球内的细胞进行定量就变得非常重要，这不但会影响药物筛选的结果，对于区分不同 Hit 的药效或作用，尤其是肿瘤个性化治疗效果的体外准确评判，具有非常关键的作用。

细胞球作为一个三维结构，可通过其二维投影或二维结果来间接反映三维结构的特性。对于宽场荧光成像和明场成像，由于其 Z 轴分辨能力较弱，通常难以直接进行三维重构和分析，而主要进行二维方法进行分析。当然，目前有多种 3D 反卷积算法，如AutoQuant、Huygens 等提供的 3D 反卷积盲算法能够大大提高宽场荧光的 Z 轴分辨率，其结果可以以三维的方法进行分析，参考后文。

要获得二维投影图像，需要对细胞球进行 Z 序列成像后，来获得二维的最终投影图像。

如上图，先对细胞球的各个层面位置进行 Z 序列成像后，对获得的Z序列图像进行景深扩展或 Best Focus 处理后，能够得到 3D 细胞球的高质量 2D 投影图像。其中 Z 序列图像通常不采用最大投影（Maximal Projection）的方法，因为该方法会造成背景信号的累积，降低最终 2D 投影图像的信噪比，并最终影响到分析结果。

获得的 2D 投影图像，采用常规的 2D 分析方法，即可实现对于 3D 细胞球的定量分析。

对于共聚焦成像系统，由于系统本身就提供很高的 Z 轴分辨率，可通过对 Z 序列图像的每一层图像进行 2D 分析，对获得的每一个 2D 结果平均化 / 或求和后，来反映 3D 结构的信息。

2D 是 3D 的投影或者子集。因此当通过共聚焦或 3D 反卷积获得了 3D 细胞的 Z 序列图像，获得了细胞球的 3D 内部信息后，通过 2D 的方法进行分析获得的结果只能从一个角度了解一个 3D 结构的信息，而无法获得全貌。因为 2D 只是 3D 的一个子集，所以 2D 的结果会由于方法的不同，会产生较大偏差（如下图）：

（1）采用 2D 投影法会造成结果明显偏低

右侧为 3D 细胞球 Z 轴扫描其中的两个层面。其中层面 3 和层面 5 在图像相同的位置上（红圈）均有细胞，即在同一个位置上的上面和下面均有细胞，这些细胞在获得景深扩展图像中就类似于同一个细胞，造成 2D 投影法分析获得的细胞计数结果明显偏低。

（2）采用分层求和法会造成结果明显偏高

右侧为 3D 细胞球 Z 轴扫描其中的两个层面。其中层面 8 和层面 9 均拍摄到了同一个的不同层面，造成分层求和法分析获得细胞计数结果明显偏高。

（3）当需要检测不同细胞的距离和位置等空间信息时，两种方法也会造成明显的问题，如分层求和法无法进行位置和距离信息的测定；2D 投影法由于获得的只是一个平面的投影，其结果会明显偏低或错误（如细胞上下层叠时） 

当然，要想全面准确地获得 3D 细胞球的信息只能通过 3D 分析方法。3D 分析方法能够自动对 3D 细胞球进行三维空间重构，并在重构的三维空间进行细胞的定量测量（细胞数量，大小，体积，表面积等）和位置信息测量（空间距离、位置等）。

3D 细胞球实验准确的数据结果依赖于 3D 分析工具来实现。ImageXpress Micro 高内涵系统具有高性能的 3D 分析工具。可以实现软件自动在三维层面识别细胞，并自动进行三维结构重构，并在重构的三维结构中进行细胞的识别和分析。

ImageXpress Micro 高内涵系列提供的 2D 分析工具和 3D 工具。可通过 2D 分析算法识别任意需要分析的结构并通过 3D 连接重建工具进行 3D 识别分析，或者在 3D 空间上直接进行所需分析结构的 3D 识别分析。

左上：水凝胶基质内生长的 3D 细胞球的重建，可以看到，除了能够将整个 3D 细胞球作为整体进行重建和获得整体空间测 量信息外，还能够对细胞球内每一个细胞（和细胞器）进行三维重构和 3D 信息的计算。

右上：一个组织切片一个区域的 3D 重构。

左下：表达 GFP 的斑马鱼肝脏的三维重构。绿色，荧光信号的重构；蓝色：设定识别的特定区域的重构。

右下：斑马鱼肝脏 3D 结果中观察肝脏在 XY、YZ、XZ 不同方向上的截面。