工程细胞株开发之单克隆化与单克隆源性检定

工程细胞株开发系列的前两篇文章我们讨论了表达体系的选择（工程细胞株开发系列之表达系统对比），转染手段的选择与稳转株筛选（工程细胞株开发系列之细胞转染），建立工程细胞株的下一步就是细胞单克隆化及验证。

细胞的单克隆源性验证在确保生物制药产品的纯度和均一性上至关重要，因为涉及产品安全性，FDA 的政策和法规都强制要求生物制药企业提供清晰图片证据，用以证明单克隆抗体研发过程中的单克隆源性。这些要求对我们的单克隆接种及成像设备提出了更高的要求。

单克隆化

目前常用的单克隆化手段有以下四种。

半固体培养基法（ClonePix挑选单克隆）

Part 1

ClonePix 是一个高通量的单克隆筛选设备，在半固体培养基中使用机器进行筛选。相对于有限稀释法，ClonePix 使用半固体培养基，应用荧光显色的方法挑选高表达克隆，因此具有人工干预少、通量大、效率高的优点。ClonePix 系统将单细胞分离和产率筛选整合成一个步骤，从而大大缩短了筛选时间且增加了候选物数量。在细胞株开发阶段，相比传统有限稀释法，可以轻松将筛选通量提高 10 倍，而所需的人工操作时间更短，通过筛选大量细胞克隆可从中发现稀有的高表达细胞株。

Molecular Devices ClonePix 2

有人通过实验，在 ClonePix 克隆挑选参数设置中，将克隆间距离作为一个主要关注指标，经过单纯的一轮克隆筛选，克隆距离为 1.0～1.2mm，单克隆率为 93%，挑选克隆距离大于 1.25mm，单克隆率大于 99%，并确定一轮以上克隆筛选必需达到 99.5% 以上的单克隆率。在实际药品工艺开发过程中，应用该方法挑选单克隆，一般会使用 ClonePix 连续挑选两轮克隆，或在 ClonePix 挑选过后增加一轮有限稀释法挑选亚克隆，以增加单克隆率。

单细胞分离法（单细胞打印机）

Part 2

单细胞打印机是这几年刚刚推出的新设备，可以显著减少克隆筛选中对人工的依赖，提高了筛选效率和准确性。单细胞打印机的原理是将含有细胞的样本放入细胞分离槽，并将液滴从细胞分离槽喷嘴喷出，用高分辨率相机拍摄5张照片捕捉这一过程，以确定每个液滴的细胞数，当检测到多细胞或无细胞时，液滴被吸走。单细胞打印机能够以温和的方式分离细胞，维持高细胞活率，从而显著提高单细胞克隆的比例，提高工作效率降低成本。

流式分选法

Part 3

流式分选法（FACS）在应用于挑选单克隆时，需要通过条件优化，使挑选的细胞与孔板的孔一一对应。在整个筛选过程中，细胞的形态及状态会对条件和分离效果产生影响。流式细胞仪在分选过程中，无论是分选时的加电，还是高流速的剪切力，都会对细胞形态与活率产生不利影响。Beckman Coulter 去年推出的 CytoFLEX SRT 分选型流式细胞仪可以很好的解决以上问题，低压分选配合不加电的垂直分选，可以很大程度的保证细胞活率，提高单克隆化成功率。FACS 法的单克隆形成率很高，并且 FACS 可以和单克隆成像系统连用确定单克隆源性，单克隆率超过 99%。但在没有成像系统辅助的情况下，一般认为单纯的一轮筛选是不够的，可以通过有限稀释法挑选亚克隆来增加单克隆率。

CytoFLEX SRT 分选型流式细胞仪

有限稀释法

Part 4

有限稀释法操作简单，对仪器设备的需求比较少，并且方便与成像系统关联使用，是目前应用较多的单克隆挑选方法。有限稀释法的单克隆培养基在通过优化后和后期工艺培养基更接近，克隆在孔板的表现更接近在生产过程中的表现。其缺点是效率比较低，需要在大量的 96 孔板或 384 孔板中进行挑选才有可能获得理想的克隆。不借助成像设备的情况下，只做 1 轮有限稀释很难确定所选细胞是单克隆。有限稀释法对人工依赖比较高，不同操作人员的操作习惯差异会影响实验结果，并且不同公司或硏究机构在细胞株、单克隆培养基等方面存在的差异同样会带来实验结果的差异，因此计划使用该方法的科研机构或公司，需要建立自己的平台方法，同时使用固定的操作人员来减少误差，如果条件允许可以使用自动化工作站对工程细胞进行有限稀释的操作。

Beckman Coulter Biomek i-Series Automation Workstation

单克隆源性检定

单克隆源性是产品表达和质量均一性的前提和保证。在提供单克隆证据方面，单克隆成像技术的出现具有重要意义。不同于概率计算和统计，单克隆成像系统可以提供直接的影像证据，是目前可以确定单克隆的可靠方法。CloneSelect® Imager 细胞生长分析系统是一个高通量自动化解决方案，可用于哺乳动物细胞的成像和分析。通过多个时间点的成像跟踪可轻松地回溯源自单个细胞的克隆形成过程。自动采集和分析可提供准确、客观和一致的结果。详细的成像和综合数据分析可确保作出更好的决策。凭借在 90 秒内对 96 孔板进行成像的能力，该细胞生长分析系统将提高通量和效率。

Molecular Devices CloneSelect® Imager

工程细胞株表征与质控

工程细胞在传代过程中有可能发生基因型和表型的突变，即使同一细胞来源的细胞库也很可能存在不均一性。即使是单克隆来源细胞也难以作为稳定的工程细胞用于生产，所以我们需要对目标细胞株进行长期稳定性观察，重点是细胞株超过可能的生产周期代次后的产品质量的一致性。细胞株的表达量和产品质量的稳定性需要通过实验进行验证，而稳定性实验时间的选择则需要根据预期传代次数决定。

后续我们将与大家详细探讨产品的表征与质控，敬请关注。

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