景杰学术 | 报道
血液是临床中最为常用的检测标本，其中的蛋白质变化作为标志物可以指征多种疾病的发生和进展。从常规体检的谷丙转氨酶，到癌症诊断的AFP、CA125等蛋白指标，都为临床诊断提供了不可或缺的重要信息。近年来，随着质谱技术的进步，通过组学方法来筛选新的血液标志物，已经成为了一个越来越重要的研究和转化应用的方向[1、2]。
利用目前高通量筛选的蛋白质组学技术，在临床病人如肿瘤患者血清中筛选标记物，其思路一般是首先运用大规模的Discovery Proteomics分析方法，对比临床病理样本中的差异目标蛋白，然后使用的Targeted Proteomics（靶向蛋白组）技术针对目标蛋白进行扩大样本的验证，最后使用抗体进行最终的确证。然而，血液因其特殊的蛋白质组成结构，使得其在组学层面上检测一直面临着较大的困难。
图、高通量蛋白质组学筛选血液标志物策略[3]
这主要有两个方面的原因：首先，相比于一般的组织细胞类样本，血液蛋白质含量的数量级跨度更大——可达1012数量级（图1），也就意味着有些蛋白含量很高，而有些蛋白的含量又极低。这种情况对仪器检测能力来说是巨大的挑战。其二，这些蛋白质不但含量差异大，而且分布非常不均匀。在血浆/血清样品中，仅仅血清白蛋白（HSA）这一个蛋白，就占据了全部蛋白约50%的含量；而前22种蛋白的集合，更是占据了全部蛋白99%的含量；剩下上万种蛋白加起来，只占了不到1%的份额。
图1. 血液中蛋白质含量的数量级分布
那么，是否有其他的方式来解决高丰度蛋白的困扰呢？景杰生物“Blood+/PRM2“血液蛋白组定量整合策略，能够显著提高血液等富含高丰度蛋白样品的检测深度和可靠性，实现血液蛋白质组从发现到验证的全流程升级，为血液标志物筛选提供新的强大工具。
“Blood+”高深度检测
“Blood+”血液蛋白质组检测技术，整合了FAIMS离子过滤技术和机器学习标志物筛选方法，能够显著提高检测深度和可靠性，尽可能多的覆盖到低丰度蛋白。FAIMS是一种气态的离子过滤装置，通过电场的作用可以使得某些离子信号被偏转出去，从而降低样品的复杂度，有利于后续质谱对肽段信号的鉴定。根据实际测试的结果，通过FAIMS装置进一步过滤筛选掉高丰度的干扰信号，能够将血液的检测深度从600多提升到1000，提升超过50%的幅度（图2左），同时能够保持良好的定量平行性（图2右）。
图2. 左为使用FAIMS前后的血浆蛋白质鉴定数目；右为使用FAIMS的两次技术重复的平行性分析
基于FAIMS的血液蛋白组检测，相比于传统的方法有一系列的优势。相比于传统TMT的方法，其不受制于标记通道数的限制，适用性更加广泛；相比于传统的DDA方法，其不会造成大规模分级而推高的成本；相比于传统的DIA方法，其在实现蛋白组深度覆盖的同时不会牺牲鉴定的可靠性。该检测方法特别适合于大规模队列样本的分析，结合机器学习的原理，能够为血液标志物筛选提供新的强大工具。
PRM2靶向蛋白组精准验证
PRM 靶向蛋白质组学技术具有高特异性、高灵敏度，高通量、无需抗体等优势，是目前蛋白质组学验证的主流方法之一。由于血清、血浆、血清外泌体等样品中高丰度蛋白比例达到97%~99%，且其中蛋白丰度的跨越12个数量级，对于质谱的鉴定造成了很大的挑战。受限于质谱平台的较窄的动态范围（6-8个数量级），致使部分关注的低丰度蛋白无法使用传统PRM技术（PRM1）方法进行验证。
PRM2靶向蛋白组技术采用合成标准肽段的方式，构建二级谱图库，极大的提高了对低丰度蛋白的定量准确度和覆盖度。通过这种方法，PRM2技术可以一次检测更多的靶蛋白，相比PRM1单次蛋白数目提升一倍，并且最高可验证到intensity排名前60%的蛋白（PRM1最高可验证到intensity排名前40%的部分蛋白），满足更多检测的需求。同时，PRM1方法的定量准确性会受到谱图库中其他碎片离子的干扰，PRM2方法可排除碎片离子干扰，极大提升PRM定性和定量结果的准确度。
注：“√”表示PRM2可鉴定；“YES”表示定量趋势可验证； 表示PRM1仅能鉴定到该蛋白。PRM2最新下机数据，针对人血浆样本Blood+项目，挑选差异>1.5倍的10个蛋白进行PRM2验证，PRM2能验证到Intensity排名低至60%的大多数蛋白，而PRM1仅能验证到1个蛋白，PRM2灵敏度明显高于PRM1。
整合“Blood+”血液高深度检测和PRM2靶向精准验证的系统方案，现由景杰生物率先独家推出，实现血液蛋白质组从发现到验证的全流程升级，详情可联系销售工程师或致电400-100-1145。
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参考文献
1. Zeyu Sun., et al., 2019, Circulating proteomic panels for diagnosis and risk stratification of acute-on-chronic liver failure in patients with viral hepatitis B. Theranostics.
2. Bo Shen, et al., 2020, Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-19 Patient Sera. Cell.
3. Philipp E Geyer, et al., 2017, Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Mol Syst Biol.
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