蛋白质组学专题 | 蛋白质组学样品前处理之蛋白提取

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在公众号的第二系列推文《蛋白质组学专题 | 一文读懂蛋白质组学研究策略及研究内容》中提到，蛋白质组学技术一般包括样本预处理、蛋白酶解除盐、质谱检测和数据分析。其中样本预处理是整个蛋白质组学方法步骤的第一环，也是决定后续步骤能否顺利进行的重要环节。因此，样本预处理的好坏直接关乎到实验能否成功。今天我们就来聊一聊样本预处理的那些事。

样本预处理就是用一系列的手段和方法，从样本中提取蛋白，并处理成可用于质谱上机的肽段混合物的整个过程。包括蛋白提取、定量、还原烷基化、酶解、除盐等，有些蛋白质组学方法还包括标记、富集、HPLC分级等流程。

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图1 蛋白质组学实验流程

在讲蛋白质组学样本前处理之前，我们来看下为什么样本前处理比较重要。

收取样本之后，经过前处理得到蛋白，拿到处理好的蛋白样品以后，我们将样品酶解成肽段，然后质谱上机得到一级谱图，再由母离子肽段与惰性气体碰撞生成碎片离子，得到二级谱图。然后我们用质谱产生的谱图与样本物种所对应的数据库理论谱图进行匹配，从而判断肽段的氨基酸组成，然后再根据肽段反推出蛋白质（如图二所示）。所以，对于每个蛋白质来说，能够匹配上的实际谱图越多，这个蛋白的鉴定结果就越可信。

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图2 谱图与肽段和蛋白的匹配

那么如何提高蛋白质组学鉴定的深度和准确性呢？从质谱层面来来讲，就是需要提高谱图数，提高肽段匹配率，提高蛋白鉴定的准确性。要满足上面的三个要求，这就需要我们在前处理上需要在保证提取蛋白的完整性的前提下，尽可能的提取出样本中所含有的蛋白，同时尽可能的减少实验误差。

既然蛋白质组学对前处理提出了要求，那么我们再来看下前处理到底可以分为那些部分。样本前处理的步骤包括样本收集与保存、样本破碎、样本蛋白提取、还原烷基化、蛋白酶解以及除盐。其中样本收集与保存、样本破碎、样本蛋白提取在很大程度上决定了样本前处理的效果。

接下来围绕这三个方面，我们来看看样本前处理那些事儿。

样本预处理之前，需要先收集和保存样品。如果收集的方法或者保存的方式不得当，就会严重影响后面的预处理步骤以及实验结果！

一般来说，对于组织样本通常用PBS清洗然后液氮速冻，-80℃保存，寄样时用干冰运输。有条件的建议用灌流的方式来去血，然后液氮速冻保存。对于植物样本，先用清水清洗植物表面灰尘，然后用无尘纸拭干水分，液氮速冻，-80℃保存，寄样时用干冰运输。对于细胞类样品：细胞取好后，也需要用PBS清洗一下细胞表面，去除可能含有的血清和胰蛋白酶。此外，还有一些其他的样本收集方法，详细请参考我们公司发布的样本收集手册。

总之，样本的收集上要尽可能去除对后续组学实验能造成影响的杂质，保持收集样本之间的均一性，同时也需要尽可能的避免样本蛋白蛋白的降解。

●匀浆：一般适用于亚细胞器的破碎或者一些软组织，如肝脏样本的前处理。目前组织匀浆的方法比较多，手持式匀浆器由于其高效、简单的性能被广泛运用。

●液氮研磨：液氮研磨是蛋白质祖学样本前处理最金典的样本破碎方法，适用于大部分组织样品，比如常见的胃脏样品、肠样品、肝脏样品、植物组织样本等。对于植物样本、革兰氏阳性菌等研磨尤其重要，研磨破碎效果直接影响项目质谱鉴定的深度和准确性。

●捣碎法：用研磨的方法破碎样品，如果样品数多，那可是件非常辛苦的事情！于是一些公司推出了组织研磨仪，利用玻璃珠或者磁珠剧烈地震荡，或者用刀片高速旋转，帮助我们做样品破碎。虽然，在一定程度上是提高了效率，但是局限性也很大，对硬度比较高的组织样本破碎效果很差，如癌症组织，皮肤组织等；对样本量较少的样本损失量较大。此外，由于剧烈震荡会产生大量的热，在一定程度上会导致蛋白降解。

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图3 常见的样本破碎方法

●温差法：通常用于细胞样本破碎，利用高温和低温的反复变化，破坏细胞膜，从而释放蛋白。

●压力差法：适用于组织样品，通过高压和低压的反复变化，实现对组织样品的破碎，

●化学处理法：使用各种化学试剂等，破碎细胞的膜结构，导致细胞的破碎。如EDTA，离子表面活性剂等。

说到样本蛋白提取，就不得不提到目前常用的几种蛋白裂解液以及各种裂解液的处理方法和优缺点。在蛋白提取中，我们常用的蛋白提取裂解液有8M尿素、SDS、SDC、RIPA、酚提取液等等。

上面列出的一些重要的试剂，我们来详细聊一聊这些裂解液：

✦ 8M尿素：这是一种比较强的变性剂，能提取大多数样本中的蛋白质。对各类蛋白质提取能力比较均衡，无明显偏好性，且尿素与BCA定量试剂盒兼容，不需要额外步骤去除，在样本的前处理中运用的比较常见。

需要注意的是，尿素受热易分解，当温度超过37℃后，尿素分子会降解使蛋白的氨基胍基化，从而影响蛋白质的理化性质，还有可能会影响酶解效果以及后续数据检索！此外，8M尿素会让胰酶也变性，失去活性，胰酶酶解时要将尿素稀释到1M以下。

✦ SDS：是一种裂解能力很强的裂解液，能提取样本中的绝大部分蛋白。由于其超强的裂解能力，能处理的样本类型比较多，包括动物、植物、细胞样本都能用SDS裂解。

SDS裂解液的劣势在于在提取蛋白的同时也会提取一些非蛋白成分，造成提出来的蛋白比较脏，质谱谱图背景比较高，在一定程度上会影响蛋白鉴定。另外，SDS与胰酶不兼容，也不与质谱兼容，而且常规的方法比较难以去除，需要用到有机试剂沉淀（如丙酮沉淀），操作步骤比较繁琐。虽然SDS裂解有诸多好处，但一般实验室中运用的比较谨慎。

✦ SDC：也是一种较强的裂解液，常与TCEP和IAA连用，用于蛋白的提取酶解和还原烷基化。由于SDC在低浓度下对酶的活性影响很小，且在酸性条件下能够沉淀析出的特性，能将蛋白质组学前处理的步骤集成化，大大的缩短了前处理的时间，提高效率。但是,SDC裂解蛋白中需要用到高温加热步骤，可能会造成蛋白修饰破坏，因此该方法不适合用于修饰组学的样本蛋白提取。

✦ RIPA裂解液：是一种传统的细胞、动物组织快速裂解液,分为弱、中、强三类。该裂解液提取的蛋白有生物活性，可用于IP等实验，且该类试剂对膜蛋白的提取有偏好性；缺点是含有去污剂与质谱不兼容，需要沉淀去除，实验步骤多，且对植物蛋白提取能力较弱，适用范围局限性较大。

✦ 酚提取试剂：是一种强蛋白提取液，对大多数样本都有比较好的提取效果，一般常用做对顽固植物组织样本的蛋白提取，如植物根、茎等组织部位。由于提取中需要用到苯酚、丙酮等有毒的有试剂，在实验中需谨慎使用，此外，该方法提取蛋白实验流程比较繁琐，增加了实验误差，这些因素都限制了该方法的运用。

总的来说，各类样本破碎方法、蛋白裂解液在前处理中都有自己的优势和缺点，实际操作中，我们通常会将几种方法结合起来使用。比如先液氨研磨，结合比较强的变性剂的方法，再加上超声的方法，来提取样本中的蛋白，以达到充分获取样本中蛋白的目的。

最后，需要提一下耗材的问题。整个处理过程中，所有使用的EP管、枪头、装试剂的塑料瓶，含有大量的聚乙二醇，而聚乙二醇非常容易离子化，会在质谱中形成很强的塑料峰，甚至会完全掩盖目标肽段的峰，影响蛋白质组学质谱检测，甚至导致检测的失败。故，实验中也需要考虑耗材对实验造成的影响，选择合适的耗材进行蛋白质组学实验。