本文作者:北京大学 杜珂 博士
2021年11月16日,哈尔滨工业大学 李浩宇教授(超视计首席专家)团队与 北京大学 陈良怡教授(超视计首席科学家)团队合作,以封面论文的形式在 Nature Biotechnology 上发表Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy【1】。
这篇文章提出了 稀疏解卷积(Sparse deconvolution)方法,可突破现有荧光显微系统的光学硬件限制,首次实现通用计算荧光超分辨率成像,可提供目前活细胞光学成像中超高空间分辨率(60nm)下,速度更快(564Hz)、成像时间更长(1小时以上)的超分辨成像。
稀疏解卷积(Sparse deconvolution)是基于“荧光图像的分辨率提高等价于图像的相对稀疏性增加”这个通用先验知识,结合陈良怡教授团队在2018年Nature Biotechnology文章中提出的信号空时连续性先验知识【2】而发明的两步迭代解卷积算法。
稀疏解卷积(Sparse deconvolution)的出现,打破了基于光学硬件或者荧光探针的改进无法进一步提升活细胞时空分辨率的僵局。
【活细胞超分辨成像小知识】
2014年诺贝尔化学奖授予了荧光超分辨显微技术,利用荧光分子的化学开关特性(PALM/FPALM/STORM)或者物理的直接受激辐射现象(STED),实现超越衍射极限的超分辨成像。尽管如此,活细胞中的超分辨率成像仍然存在两个主要瓶颈:
(1)超分辨率的光毒性限制了观察活细胞中精细生理过程;
(2)受限于荧光分子单位时间内发出的光子数,时间和空间分辨率不可兼得。
受限于这个瓶颈,为了在活细胞上达到60 nm空间分辨率极限,现有超分辨率成像手段需要强照明功率(kW~MW/mm2)、特殊荧光探针和长曝光时间(> 2 s)。强照明功率引起的强漂白会破坏真实荧光结构的完整性,长曝光时间在图像重构时导致运动伪影,降低有效分辨率。
迄今为止,基于光学硬件或者荧光探针的改进无法进一步提升活细胞超分辨率的时空分辨率,实现毫秒尺度60 nm的时空分辨率成像。
稀疏结构光显微镜(Sparse-SIM)的搭建,正是使用了Olympus双层倒置荧光显微镜IX83配合高数值孔径(NA)油浸物镜实现。
值得一提的是,本次研究【1】与2018年Nature Biotechnology发表的Hessian SIM文章【2】中,两篇超高分辨率研究文章均使用了Olympus独有的NA值高达1.7的超高分辨率物镜APON100XHOTIRF。
超分辨成像征程的每一步,我们一直风雨兼程,与君同行,让文献里遥不可及的理论算法,化为您手上披荆斩棘的研究利器。
接下来,我们结合文章数据一起看看搭载了稀疏解卷积(Sparse deconvolution)算法的 SIM-ultimate 可以实现哪些应用呢?
为了在已知结构样本中验证分辨率的提升,研究者设计并合成了两个荧光标记位点的DNA折纸样本,每个位点用4~5个Cy5标记。
当这些分子间距为60 nm、80 nm和100 nm时,它们在TIRF-SIM下几乎无法区分,但在经过稀疏解卷积重建后(Sparse-SIM,图1)可以很好地区分它们中间的距离。
整体结果可以用单分子定位显微镜ROSE【3】交叉验证,与Sparse-SIM得到的DNA折纸的荧光对间距以及不同间距荧光对在玻片上的分布一致。
图1:Sparse-SIM解析不同距离DNA折纸样本。(a)在相同视场下,用配对Cy5标记不同距离(60 nm, 80 nm, 100 nm, 120 nm)的DNA折纸样品,用TIRF(左)、TIRF-SIM(中)和Sparse-SIM(右)成像。(b)在TIRF、TIRF-SIM和Sparse-SIM下,黄色(60 nm)、蓝色(80 nm)(80 nm)、绿色(100 nm)和红色(120 nm)框包围的放大区域。比例尺:(a)2 μm;(b)100 nm。
2. 应用举例:Sparse-SIM超快活细胞
成像揭示核孔结构和胰岛素囊泡早期融合孔道
图2:Sparse-SIM解析核孔蛋白动态过程。(c)用Sparse-SIM观察活COS-7细胞中以Nup98-GFP标记的动态环状核孔的典型例子,持续时间超过10分钟。上下区域分别显示2D-SIM和Sparse-SIM下的图像。(d)比较 (c)中青色框中的核孔结构快照与100 nm荧光珠在不同重建方法(2D-SIM、20次RL解卷积后、50次RL解卷积后、Sparse-SIM)下的结果。(e)由于核孔的大小与Sparse-SIM的分辨率和像素大小相当,按照Supplementary Note 9.1的协议(详情请见文章),分别推导出Nup35-GFP(红色)、Nup98-GFP(黄色)、Nup93-GFP(绿色)和Nup107-GFP(青色)标记的核孔结构的实际直径。(f)Nup35(66 ± 3 nm, n=30)、Nup98(75 ± 6 nm, n=40)、Nup93(79 ± 4 nm, n = 40)、Nup107(97 ± 5nm ,n = 40)的平均直径环。左右两幅蒙太奇分别为传统Wiener重构或稀疏解卷积后的结果。(g)在6个时间点对 (c)中的品红色方框放大并显示。比例尺:(c)500 nm;(d, g, f)100 nm。
图3: 稀疏解卷积广泛应用于提升不同显微成像模态空间分辨率,揭示各类细胞器精细结构动态。
比如稀疏解卷积增强的商业超分辨转盘共焦结构光显微镜(SD-SIM)【7】,可以实现XY方向90纳米nm,Z方向250nm 纳米的空间分辨率,清晰记录分裂期7 μm深度内的全细胞内所有线粒体外膜网络(图4)。同样,若稀疏解卷积增强与商业SD-SIM结合,因此,在SIM-ultimate系统上可以很容易实现活细胞上的三维、四色超分辨率成像。
此外,稀疏解卷积还可以与膨胀显微镜(ExM)【8】结合,解析细胞膨胀后的复杂结构;也可以与宽场、点扫描的共聚焦、膨胀显微镜(ExM)【8】、受激辐射损耗显微镜(STED)【9】以及微型化双光子显微镜(FHIRM-TPM 2.0)【10】结合,实现近两倍的空间分辨率提升。因此,稀疏解卷积的提出,将帮助使用各种各样荧光显微镜的生物医学研究者更好地分辨细胞中的精细动态结构。
图4: Sparse SD-SIM解析活细胞三维线粒体外膜网络。(k)活体COS-7细胞的线粒体外膜(Tom20-mCherry标记)的三维分布,颜色表征深度。(l)SD-SIM原始数据与Sparse SD-SIM的水平(左)和垂直(右)的白色框区域放大展示。比例尺:(k)5 μm;(l)1 μm。
4. SIM-ultimate: 摘星揽月 触手可得
参考文献:
[1] Weisong Z, Shiqun Z, Liuju L, et al. Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy [J]. Nature biotechnology, 2021: DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-021-01092-2.
[2] Huang X, Fan J, Li L, et al. Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy [J]. Nature biotechnology, 2018, 36(5): 451-459.
[3] Gu L, Li Y, Zhang S, et al. Molecular resolution imaging by repetitive optical selective exposure [J]. Nature Methods, 2019, 16(11): 1114-1118.
[4] Szymborska A, Marco A d, Daigle N, et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging [J]. Science, 2013, 341(6146): 655-658.
[6] Ornberg R L, Reese T S. Beginning of exocytosis captured by rapid-freezing of Limulus amebocytes [J]. The Journal of Cell Biology, 1981, 90: 40 - 54.
[7] Schulz O, Pieper C, Clever M, et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy [J]. PNAS, 2013, 110(52): 21000-21005.
[8] Sun D-E, Fan X, Shi Y, et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules [J]. Nature Methods, 2021, 18: 107–113.
[9] Hell S W, Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy [J]. Optics Letters, 1994, 19(11): 780-782.
[10] Zong W, Wu R, Chen S, et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging [J]. Nature Methods, 2021, 18(1): 46-49.
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