有了这篇经验分享，活细胞成像实验再也不愁了

图1. 四重标记的U2OS 活细胞成像结果。微管蛋白用 Tubulin Tracker Green 染料标记，线粒体用 MitoTracker Orange 染料标记，质膜用 CellMask Deep Red染料标记，细胞核用 Hoechst 33342 试剂标记（蓝）。

固定细胞成像在研究靶点分子的定位方面有着极其广泛的用途，而活细胞成像在如下研究中具备更大的优势：

• 分子定位与运动随着时间的变化

• 动态的复合体组装和分子间相互作用

• 细胞内成分的组织

• 囊泡或病毒颗粒的行为

• 细胞对环境刺激的反应

所以，活细胞成像实验设计和操作过程中需特别注意：

• 须通过特定方法实现以最小毒性标记靶标——无论是靶分子、细胞功能还是细胞状态；

• 活细胞通常很难允许某些大的检测分子通过；

• 移动的观察目标更难保持聚焦；

• 使用的检测技术是否对活细胞有损伤。

• 一些强健的永生化细胞系能在无专门环境控制的条件下忍受短时成像；

• 在某些短时成像实验中，使用较大的培养基体积可避免由于挥发所导致的渗透压和含氧量变化问题；

• 而对于长时成像研究，除了在培养基中添加碳酸氢盐缓冲系统外，使用带有加热模块可控制温度、湿度与 CO₂ 的小培养室或大温控箱来精确控制环境也十分重要。

随着活细胞成像的普及，对实验中荧光基团标记的要求也越来越高，活细胞成像实验如何实现更好的荧光标记？一起奉上如下注意事项：

• 如需长时间曝光，请尽量选择用更长波长的荧光试剂，长波长试剂只需较低的激发功率，具有更低的光毒性，可以提供更健康的细胞状态；

• 推荐针对特定的检测读值、光谱兼容性和信噪比对染色进行优化；

• 去除标记溶液，并使用新鲜配制的培养基冲洗，可减少背景荧光；

• 搭配多种荧光基团实现多重标记，推荐使用Stain-iT细胞染色模拟工具（图2）或荧光光谱查看器，以确保荧光染料间光谱重叠最小。

图2. Stain-iT细胞染色模拟工具

今天我们一起来看看活细胞成像几个常见的问题要怎么解决：

解决方法：将激发光调弱并且在进行拍摄设定时避免照射激发光，不进行拍摄的时候将激发光切断。

解决方法：提供合适（温度、二氧化碳浓度、湿度）的培养室及恒温箱（如新一代EVOS智能活细胞成像系统，图3）；用水分不会蒸发的多孔培养板来培养细胞；处理时避免空调等的风直接吹到样品。

图3. 新一代EVOS智能活细胞成像系统（右）

活细胞成像试剂包括靶向性荧光融合蛋白和膜渗透荧光染料。许多活细胞成像试剂可用于数小时或数天的延时成像，也有一些试剂适合终点检测、细胞染色后立即成像和分析。染色浓度、孵育时间、成像时间和间隔/频率应根据经验确定，以尽量减少细胞毒性并保留细胞功能。

我们整理了下列活细胞成像试剂选择指南供大家参考——该指南根据研究靶点分类，列出了跟Thermo Fisher Scientific 的 EVOS和Sartorius 的 Incucyte活细胞分析系统各通道适配的试剂。

图4. 活细胞成像试剂选择指南

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*飞享价截至12/31/2023。