景杰生物 | 报道
蛋白质磷酸化是最常见和功能最重要的一种翻译后修饰，几乎所有的细胞信号通路都受到磷酸化修饰的精密调控。但传统磷酸化定量技术通常存在吞吐量有限和重复性低的问题，尤其是对于大队列样本的系统研究及临床应用来说。由于磷酸化修饰自身的复杂性和目前质谱仪采集速度和灵敏度的局限性，如何提高样本分析通量、数据完整性以及批次的定量稳定性，目前仍然是一大挑战。
蛋白质组学技术依据定量策略的不同分为数据依赖型(Data-dependent Acquisition, DDA) 策略和数据非依赖采集 (Data-independent Acquisition, DIA) 策略。相较于DDA在一级质谱中在每个时间窗口采集信号较强的有限肽段离子进入二级质谱进行碎裂分析，DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，并循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，缺失值更少。但传统DIA的数据采集策略会使得谱图高度复杂，给数据解析带来极大的挑战，并且其定量可靠性也存有一定的争议。
4D-DIA磷酸化修饰组技术结合了以捕集型离子淌度（Trapped Ion Mobility Spectrometry, TIMS）为特征的4D蛋白质组学，及DIA策略的优势，克服DDA和传统DIA技术原有的一些劣势，真正意义上实现了优势互补。研究发现，相比4D-DIA磷酸化修饰组学定量技术可实现更大的定量动态范围、更高的鉴定重复性，并提高了定量的灵敏度和准确性，尤其适合于临床大队列蛋白质组学研究等应用，已成为细胞信号研究、临床癌症组织的蛋白质基因组学、抗病毒药物发现研究的一项强大技术。
技术优势
01. 4D对齐，可靠性更强
DIA相比于DDA的技术而言，最大的挑战就在于其混合谱图难以可靠解析。在定量的时候，主要依据色谱洗脱时间（retention time）来进行匹配。但是，由于共洗脱现象的普遍存在，仅仅依靠色谱洗脱时间是不够的，存在很多的干扰信号，而影响了检测结果的准确性。4D技术代表性的离子淌度分离，提供了额外维度的校准信息。能够更准确从DIA的混合谱图中解析出具体的肽段信号，有效降低了谱图的复杂性，全面提升了DIA检测的准确性和可靠性。
图 4D-DIA技术有效降低了谱图的复杂性，并进一步增强了定量的可靠性。如图所示，EVGSHFDDFVTNLIEK肽段在传统DIA（上）和4D-DIA（下）中校正后的色谱图。可以看到上图的传统DIA方法中，存在较高的干扰信号；而在下图的4D-DIA中的信号背景很干净
02. 近乎100%的离子信号，灵敏度更高
4D-DIA技术中与离子淌度相关的CCS值和m/z之间有一定的相关性，因此四级杆可以利用这个特征逐步扫描来采集近乎100%的离子信号，极大提升检测的灵敏度和深度。
图 基于4D平台的4D-DIA技术可实现近乎100%的离子利用率。a，4D-DIA中的数据采集模式；b，4D-DIA和DDA及传统DIA离子利用率的对比。
03. 25%+深度提升，检测深度更高
4D-DIA相比于传统DIA能够更加准确的识别出低丰度的修饰肽段，进而提高磷酸化修饰鉴定深度。测试数据显示4D-DIA磷酸化从小鼠脑组织中可定量到20000+修饰位点，相比传统DIA技术提升25%。
04. 解决同分异构问题，修饰定量更准确
磷酸化组分析的另一大难题是同分异构现象，4D中新增的离子淌度能够区分和识别这些共洗脱的磷酸化修饰肽段信号，尤其有利于翻译后修饰位点的精确分析。
图 离子淌度对于同分异构磷酸化肽段的分离。如图所示，5号和6号肽段其保留时间和质荷比完全一样，但是通过离子淌度可以很好的分离鉴定。同时，6号和7号肽段离子淌度和质荷比一致，但可以通过保留时间进行区别。全部7个肽段中有5个可以通过离子淌度进行准确鉴定，但是保留时间只能鉴定2个。
前沿研究
Cell：新冠病毒侵染的磷酸化蛋白质组全景图
样本设计：以新冠病毒SARS-CoV-2侵染Vero E6细胞，选择了侵染的6个时间点取样（0h、2h、4h、8h、12h和24h）主要结论：研究鉴定到4,624个磷酸化修饰位点和3,036个蛋白质，并系统解析了新冠病毒侵染细胞后导致的系统性磷酸化修饰改变。结果显示，相比于蛋白质的表达，蛋白质的磷酸化修饰水平在不同时间点之间呈现出更为显著的改变，这体现了磷酸化的修饰在迅速侵染过程中有更为重要的作用。
图 SARS-CoV-2感染的磷酸化蛋白质组学分析
参考文献：
1. Mehdi Bouhaddou,et al.,2020. The Global Phosphorylation Landscape of SARS-CoV-2 Infection. Cell.
2. Florian Meier, et al., 2019. Parallel accumulation – serial fragmentation combined with data-independent acquisition (diaPASEF): Bottom-up proteomics with near optimal ion usage. Nature Methods.
公司简介
景杰生物（PTM BIO）是中国最具创新活力的蛋白质组学技术应用与开发的领先者，公司致力于为全球科研工作者和工业客户提供顶级蛋白质组学服务及高品质抗体试剂。公司以“蛋白质组学-- 精准医学”前沿研究领域为科学背景，已形成集研发、生产、服务于一体的创新型商业模式，现已建成蛋白质组学、蛋白质修饰组学技术平台、生物信息学分析平台、蛋白质修饰抗体开发平台、高效兔单克隆抗体开发平台以及大数据平台等，正在积极布局开发诊断试剂盒平台以及生物标志物平台。公司创立于 2010 年 12 月，总部位于杭州，在美国芝加哥设有子公司。
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