项目文章 | TM广靶找到危重肢体缺血治疗机制

迈维代谢

2022.1.18

作者迈维代谢

TA的动态

● 期刊：Molecules

● 发表时间：2021.12.12

研究背景

严重下肢缺血(Critical limb ischemia，CLI)是一种严重的外周动脉疾病(peripheral artery disease, PAD)，严重危害人类健康。治疗性血管新生是治疗CLI的重要策略，然而目前开发的相关药物却是有限的。白藜芦醇(Resveratrol，RSV)是一种从植物中提取的多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗癌等多种作用。而RSV对CLI的作用尚不清楚。本研究发现口服RSV可显著改善小鼠后肢缺血，并增加磷酸化Forkhead box class O1 (FoxO1)的表达。同时，利用代谢组学筛选RSV干预后改变的代谢途径，发现RSV对缺血肌肉组织的有益作用与嘧啶代谢、嘌呤代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径高度相关。本研究为CLI的治疗提供了一个新的方向。

NO.1

RSV治疗可改善后肢缺血小鼠模型的血液恢复

为研究RSV对缺血小鼠后肢的影响，采用口服RSV给药的方法，用激光多普勒成像仪测量血流灌注（图1A）。如图1A、B所示，后肢缺血手术造模后，缺血组血流灌注明显减少，而假手术组缺血肢体血流灌注无明显变化。术后第4天，缺血+白藜芦醇干预组小鼠缺血后肢血流灌注完全恢复到术前水平，缺血手术组恢复到术前水平25.62%。通过TUNEL染色评估细胞凋亡（图1C），显示缺血手术组腓肠肌凋亡细胞明显增多(图1D)。通过免疫组化染色检测CD31的表达水平（图1E），结果表明，缺血手术组血管密度增加，缺血+白藜芦醇干预组血管密度进一步增加（图1F）。

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图1

NO.2

RSV抑制缺血肌肉组织和HUVECs中的FoxO1信号通路

在实验小鼠肌肉组织中，总FoxO1蛋白的表达没有显著差异，磷酸化FoxO1的表达在缺血肌肉组织中显著降低，并可通过RSV治疗逆转（图2A，B）。在体外实验中，通过HUVECs进一步研究RSV在血管形成中的作用。缺氧条件下磷酸化的FoxO1表达量较常氧显著降低，经0.2 μM 和1 μM RSV处理后，磷酸化的FoxO1表达显著增加。此外，FoxO1的磷酸化与其核质穿梭高度相关，分别提取细胞质和核蛋白，发现在缺氧条件下，RSV处理后，FoxO1在核内的定位减少（图2E-G）。然后，通过血管生成实验，发现缺氧条件下，成管长度较常氧条件下明显缩短，两种不同浓度的RSV处理8 h后，成管长度得到恢复(图2H,I)。这些结果表明缺血情况下RSV增加了磷酸化的FoxO1，并促进了血管新生。

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图2

NO.3

RSV以FoxO1依赖的方式促进血管生成

磷酸化的FoxO1受PI3K-Akt通路调控。为了进一步探究RSV在缺氧条件下的保护作用是否依赖于FoxO1，首先通过使用Akt通路抑制剂honokiol来研究当Akt通路被抑制时，RSV对FoxO1磷酸化的影响是否会改变。结果表明honokiol可以显著降低RSV处理引起的FoxO1磷酸化表达的升高(图3A,B)。

在血管生成实验中，honokiol可以显著降低RSV处理组的成管长度(图3C,D)。然后，使用FoxO1特异性抑制剂AS1842856（AS）进一步确定FoxO1在血管生成中的作用。如图3E、F所示， AS对血管生成的影响与RSV相似，但两者间没有叠加效应。接着，通过siRNA来抑制FoxO1的表达，与NC组相比，si-FoxO1处理的HUVECs的成管长度显著增加。最后，通过质粒转染过表达FoxO1，如图3K,L所示，过表达FoxO1的HUVECs成管长度明显降低，并且RSV处理逆转了这种效应。

综上所述，这些数据表明RSV通过Foxo1依赖的方式促进血管生成。

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图3

NO.4

骨骼肌样品的差异代谢物分析

RSV可调节体内多种代谢活动。为探讨RSV是否能改变缺血后肢的代谢途径，采用液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(LC-QTOF-MS/MS)对实验小鼠缺血腓肠肌代谢物进行分析。结果显示，缺血手术组与缺血+白藜芦醇干预组相比，两组间有215个代谢物显著下调，103个代谢物显著上调(图4B)。

缺血+白藜芦醇干预组缺血肌肉组织Resveratrol - 4′- O - D -glucuronide，Sinapine和N-Caffeoyl purescine等都发生了显著变化。接着通过k-means聚类分析处理所有的代谢物。如图4D所示，在聚类分析得到的1,2,5亚类中，假手术组和缺血手术组的代谢产物存在差异，RSV治疗后又恢复到假手术组水平。利用这些筛选得到的代谢物，通过KEGG通路富集分析，并应用气泡图来展示三组之间可能发生的通路改变(图4E)。以此富集出FoxO信号通路(图4E)，进一步证实RSV对缺血骨骼肌的影响是以FoxO1依赖的方式进行的。此外，KEGG通路富集分析还发现，嘧啶代谢、嘌呤代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径FDR值小于0.001，这些代谢通路可能也介导了白藜芦醇在缺血组织中的作用。

为了验证这些代谢途径的作用，将与这三种代谢途径相关的差异表达代谢产物与小鼠后肢血流灌注数据曲线下面积(AUC)，CD31免疫组化和TUNEL染色定量值进行Spearman相关性分析。结果表明，与这三条代谢通路相关的多种代谢物与血流灌注的AUC和TUNEL定量值有显著相关性。而RSV治疗下代谢途径变化的确切机制将是我们未来研究的重点。

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图4

白藜芦醇是一种从植物中提取的多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗癌等多种作用。口服RSV显著改善了小鼠后肢缺血，并增加了磷酸化FoxO1的表达。RSV处理HUVECs可增加FoxO1的磷酸化及其胞质转位，促进血管生成。最后利用代谢组学筛选RSV干预后改变的代谢途径，发现RSV对缺血肌肉的有益作用与嘧啶代谢、嘌呤代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径高度相关。本研究为CLI的治疗提供了一个新的方向。

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