2023年2月23日，浙江大学附属第一医院郑树森教授团队在Hepatology（IF17.298），DOI: 10.1097/HEP.0000000000000320 在线发表了题为“Targeting neuropilin-1 abolishes anti-PD-1-upregulated regulatory T cells and synergizes with 4-1BB agonist for liver cancer treatment”的研究论文。该研究揭示了肝癌治疗中单独进行抗PD-1免疫治疗时发生的肿瘤微环境内Treg细胞累积现象，通过研究抗PD-1诱导Treg细胞累积的分子机制，发现Treg由外部淋巴组织迁移而来，并发现了迁移过程的关键基因Nrp-1。最后作者通过Nrp-1阻断剂与4-IBB激动剂协同治疗的方法提高肝癌抗PD-1治疗的敏感性。
期刊：Hepatology
影响因子：17.298
发表年月：2023.2.23
材料：2组PD-1治疗后小鼠分选CD4+/CD8+细胞（n=5），肿瘤接种小鼠多种淋巴组织分选CD4+/EGFP+细胞（n=5）
方法：10×Genomics scRNA-seq
免疫检查点阻断（ICB）治疗目前已经是治疗多种肿瘤的主流方法。但是针对肝癌（HCC）的PD-1单抗单独治疗的随机多中心临床试验并未取得良好效果，并且机制尚不明朗。
调节性T细胞（Treg）对PD-1阻断的ICB治疗具有阻碍作用，瘤内的Treg细胞与CD8+T细胞比例亦是一种重要的预后指标。肝脏做为一种免疫耐受器官，具有天然强大的抑制性免疫微环境，Treg等免疫抑制细胞大量浸润。介于瘤内Treg细胞主要来自于外周淋巴组织迁移而来，研究Treg迁移的轨迹以及Treg在适应迁移后发生的转录组特征改变，对Treg细胞趋化机制，以及针对Treg细胞迁移进行特异性靶向治疗具有重要意义。
Result1 PD-1治疗后并未缓解肿瘤内免疫抑制，且Treg细胞出现累积。
为了探索PD-1阻断治疗后肿瘤微环境的变化，作者对单独进行PD-1治疗的肝癌模型小鼠以及对照组小鼠均取肿瘤组织进行了CD4+/CD8+T细胞的分选，之后进行10X Genomics单细胞测序，最终对9334个细胞进行分析。
作者首先研究CD8+T细胞在PD-1阻断治疗后的基因表达变化，发现部分毒性相关基因没有在治疗后上调表达，认为PD-1阻断未能激活毒性T细胞发挥杀伤作用。
进一步对CD8+T细胞进行拟时序分析，发现PD-1阻断治疗并没有改变CD8+T细胞的分化轨迹，在治疗后仍有大量耗竭T细胞以及增殖状态的耗竭T细胞。PD-1治疗并未能扭转肿瘤内的免疫抑制状态。
接下来，作者对CD4+Treg与CD8+T细胞的比例进行分析，发现PD-1治疗后Treg细胞出现累计效应。结合临床数据以及实验验证，发现肝癌的PD-1治疗后，Treg细胞与CD8+T细胞比例呈增长态势，并且发现Treg细胞在肿瘤内部以及周围组织均有累积。
图1
Result2 PD-1阻断后，外周淋巴组织Treg细胞增殖并迁移至肿瘤微环境。
作者进一步对Treg累积的细胞来源进行研究，通过实验排除了Treg细胞在肝癌微环境中原位增殖和TGF-β诱导的可能。通过构建连体共生小鼠模型，发现在抗PD-1诱导累积的Treg是由外周淋巴组织完成增殖并向肿瘤区域迁移 。
图2
Result3单细胞测序揭示Treg的组织适应性变化以及迁移前后的关键基因Nrp-1的变化。
为了研究Treg细胞在迁移前后发生的基因表达变化，作者对外周组织、肿瘤组织以及周围组织的CD4+/EGFP细胞进行了富集与单细胞测序，通过降维聚类获得8个细胞群，其中有6个群为Treg相关细胞。基因表达分析发现，C2具有较显著的迁移相关基因特征表达。C3具有和肿瘤免疫抑制相关的特征基因表达，推测为肿瘤区域Treg细胞（Ts-Treg）。
为了进一步了解Treg细胞的迁移轨迹与组织适应性，作者对Treg细胞进行了拟时序分析，结果发现外周淋巴来源的Treg细胞在拟时序轨迹上逐步向Ts-Treg细胞进行转化，证明了Treg细胞由外周淋巴组织迁移至肿瘤区域的推断。进一步对高变基因进行动力学分析，发现免疫抑制相关基因(如Tnfrsf9)呈现不断增强的趋势，而部分迁移相关基因（如Nrp-1）在时序轨迹上呈现出先升高后降低的趋势。之后作者为了探究Treg细胞中的转录因子以及下游靶基因的共表达情况，对Treg细胞进行了SCENIC分析，结果发现免疫抑制相关转录因子Crem以及其下游靶基因Tnfrsf9在Ts-Treg细胞中具有特异性共表达趋势，进一步说明了Ts-Treg 发挥了较强的免疫抑制功能。
为了验证Treg细胞在迁移过程中，迁移基因Nrp-1以及免疫抑制基因Tnfrsf9(4-1BB)的变化情况，作者针对临床样本以及体内模型进行了验证，发现其细胞数目的变化趋势与基因表达变化趋势基本一致，Treg细胞在向肿瘤区域迁移的过程中逐渐由Nrp-1+/4-1BB-细胞转变为Nrp-1-/4-1BB+细胞。
以上结果说明Nrp-1以及4-1BB可以作为HCC的潜在治疗靶点。
图3
Result4 转录组测序揭示Nrp-1敲除后Treg细胞迁移能力减弱。
为了进一步验证Nrp-1对Treg细胞迁移的协助作用，作者通过构建FOXP3/Nrp-1-的基因敲除鼠，分选了其脾脏以及淋巴结中的Treg细胞进行RNA-seq（N=4），差异基因以及功能富集显示，Nrp-1敲除后，细胞黏附以及趋化相关通路均出现下调，说明Treg的迁移能力受到影响。
图4
Result5 Nrp-1抑制与4-1BB激动协同治疗HCC
作者发现Nrp-1敲除虽然减轻了抗PD-1治疗有道德Treg细胞的迁移和肝癌中的积累，并延缓肿瘤发展，但是无法与抗PD-1治疗协同，唤醒抗PD-1的肿瘤杀伤作用。因此作者结合现有的研究结果，发现4-1BB的激动剂（3H3）治疗对于增强CD8+T的浸润激活，减少肿瘤Treg都具有促进作用。之后，作者通过多种小鼠肝癌模型验证了同时靶向4-1BB和Nrp-1能逆转肝癌免疫抑制微环境。在人源化HCC模型中二代4-1BB激动抗体LVGN6051与Nrp-1抑制剂EG01377协同治疗肝癌具有比单药治疗更好的抑癌效果。该双重靶向方案能逆转肝癌对帕博丽珠单抗治疗的抵抗。(这一部分图片缺如，图5)
图5
作者首先通过肿瘤组织中免疫细胞的单细胞测序分析与实验验证，发现了抗PD-1治疗HCC后的瘤内Treg细胞积累这一副作用，进一步通过对肿瘤及外周淋巴组织进行CD4+/Treg细胞分选并开展单细胞测序及分析，发现了Treg细胞由外周淋巴迁移至肿瘤组织的现象以及在迁移过程中起到关键作用的分子Nrp-1和免疫抑制分子4-1BB。通过设计Nrp-1阻断剂以及4-1BB激动剂，提出协同治疗方案并进行体内验证，取得了良好效果，为后续HCC的免疫治疗方案提出新思路。
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排版人：七七
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