【Nature】赛多生物分析三剑客助力甲病毒受体快速发现

赛多利斯实验室

2022.1.19

作者赛多利斯

TA的动态

甲病毒（Alphavirus）是包膜RNA病毒，可引发皮疹、关节痛、急性发热疾病，甚至致命的脑炎。该病毒属包括东方马脑炎病毒（EEEV）、塞姆利基森林病毒（SFV）、辛德毕斯（SINV）病毒和基孔肯亚病毒（CHIKV）等。病毒包膜蛋白以正二十面体对称排列，E2和E1糖蛋白形成异质二聚体，聚成80个三聚体，介导病毒和细胞膜的受体结合与融合。

甲病毒结构示意图

近期发表在Nature期刊的一项研究中^[1]，哈佛医学院的科学家们发现极低密度脂蛋白受体（VLDLR）是典型的甲病毒SFV的受体，而EEEV和SINV病毒的E2/E1糖蛋白也与VLDLR的配体结合域（LBD）相互作用介导病毒进入细胞，受体是与VLDLR密切相关的载脂蛋白E受体2（ApoER2）。赛多利斯生物分析三剑客——Octet®分子互作分析系统，Incucyte®实时活细胞分析系统以及iQue®高通量流式细胞仪在这篇文章中大放异彩。

研究分享

细胞水平筛选甲病毒受体

利用CRISPR和模拟甲病毒的假病毒系统在细胞水平进行甲病毒受体筛选。将甲病毒复制子系统转化为基于DNA的报告病毒颗粒（SFV RVP）系统（或称之为假病毒），GFP为报告基因。当细胞被假病毒感染后，报告基因被整合到细胞基因组中，表达GFP产生绿色荧光。构建针对人类基因组中膜相关蛋白的向导RNA(sgRNAs)文库。使用该文库对感染SFV RVPs的HEK293T细胞进行CRISPR/Cas9筛选。发现使VLDLR（极低密度脂蛋白受体）基因沉默可以抑制SFV RVP的干扰，说明VLDLR是SFV的受体。这篇文章有大量数据检测SFV RVP对细胞的相对感染率，iQue®高通量流式细胞仪当仁不让地成了这个测试的主力。

左、中、右分别为活细胞群，单细胞群和GFP阳性细胞群。

相对感染率Relative infection (%) = （加入抗体or阻断蛋白or受体的GFP阳性细胞/未加入抗体or阻断蛋白or受体的GFP阳性细胞) × 100%

左：VLDLR敲除后，SFV的感染能力大大降低

右：加入VLDLR的抗体，可以阻断SFV对细胞的感染

iQue®高通量流式细胞仪的优势在于：

高通量速度快：5分钟即可完成一块96孔板检测；
操作简便：“混匀-测定”，免洗流程，确保抗体靶点空间构象免遭破坏；
节约样品：最少仅需几微升样品，节约靶标抗原和珍贵细胞。

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iQue® 高通量流式细胞仪

分子水平研究甲型病毒
E2/E1蛋白与受体的结合

为了搞清楚甲病毒E2/E1蛋白是否直接与VLDLR和ApoER2的LBD（ligand binding domain）结构域结合，作者生成并纯化了甲病毒的病毒样颗粒（VLP）。使用基于生物层干涉(BLI)的Octet®分子互作分析系统进行分析，发现VLDLR_LBD-Fc可以直接结合SFV、SINV和EEEV VLP。而RAP（一种VLDLR阻断剂）可以阻断甲病毒和VLDLR的结合。进一步从分子水平验证了VLDLR的LBD结构域是甲病毒的结合位点。

Octet® Red 96e测试：用AHC（anti-human Fc）传感器固化受体，然后加入100 μg/mL阻断蛋白RAP或者Tf，然后与甲病毒VLP (20 nM) 结合5分钟

Octet®分子互作分析系统的优势在于：

非标记Direct binding是趋势，结果更准确；
快速测定亲和力，更加定量化地表征分子互作；
无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）；
写入了美国药典，文章多，认可度广；
万金油技术，可以用于检测DNA，小分子，蛋白质等各种生物分子，比如这篇文章检测的就是病毒颗粒样品；
操作简便，耗材及维护成本低。

细胞成像研究
病毒对细胞的感染

皮质神经元是甲病毒感染的细胞种类之一，并引起脑炎。用Incucyte®实时活细胞分析仪检测了甲病毒对神经元的感染率。加入VLDLR的LBD结构域或者RAP，可以阻断甲病毒的感染。

用Incucyte® S3检测iPSC分化的神经元对SFV RVP的感染。GCU阈值5，用Top-hat算法进行背景扣除。经过22小时培养后，计算GFP荧光面积。相对感染率Relative infection (%) = （加入抗体or阻断蛋白or受体的GFP阳性细胞/未加入抗体or阻断蛋白or受体的GFP阳性细胞) × 100%

Incucyte®实时活细胞分析系统优势在于：

贴壁生长的神经细胞相对其他细胞比较脆弱，Incucyte® S3放入培养箱中，不需要移动培养板，对拍照的人为干扰最小。而流式等技术需要对细胞消化处理，可能会大大影响其活性和检测的准确性；
配备无毒害免干扰的活细胞分析试剂，智能的神经细胞分析软件，以及趋化、迁移、3D肿瘤球和类器官模块；
通量高，一次可同时进行多达6块多孔板的实验，灵活选择不同的物镜和荧光通道。