CAR-T治疗又称之为嵌合抗原受体T细胞治疗，是目前临床上针对肿瘤的一种新型免疫细胞精准靶向治疗技术。
CAR-T疗法也是目前发展最成熟的细胞治疗方法，它是通过基因工程技术，在T细胞的细胞膜上嵌合上某种特定肿瘤抗原受体基因形成修饰的T细胞，从而特异性识别和结合肿瘤细胞表面的抗原并实现对肿瘤细胞的特异性杀伤。另一方面基因编辑技术也被广泛用于包含T细胞在内的治疗细胞的修饰，以增强其抗肿瘤效果。
基因编辑技术由于不需要导入外源基因，而且能采用不同的方式对缺陷基因进行修复，针对的疾病类型更多样，它与细胞疗法的结合为许多疾病的治疗提供了新的思路和契机。
目前该项技术主要应用于血液系统恶性肿瘤的治疗，通过对本身的T细胞进行修饰后，回输到患者体内，最终达到治疗相关疾病的目的，对于血液恶性肿瘤性疾病的治疗具有非常重要的意义。
CAR-T疗法不仅有上市产品，而且全球已有超过一千项CAR-T临床试验，开启了细胞疗法的产业化时代。
2022年4月12日，丹纳赫生命科学携手医麦客，邀请了IDT应用科学家 林萌萌、华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科助理研究员 朱莉 博士、颇尔基因细胞治疗高级技术经理 李涛 为我们带来一场主题为“多元化基因修饰助力CAR-T疗法释放应用潜力”的线上直播讲座，助力中国医药产业人才成长。
精彩回顾
林萌萌老师的讲座内容主要包括：
➤ CRISPR-Cas9/Cas12a基因编辑技术助力细胞治疗研究
CRISPR/Cas9系统是一种可遗传的原核生物适应性抗免疫系统，以传染性入侵病毒和噬菌体为靶点，利用RNA引导核酸酶切割外来遗传成分。它包含两个隔间，一个用于Cas9内切酶，另一个用于单链引导RNA(sgRNA)。sgRNA引导Cas9内切酶以序列特异性的方式切割目标基因的两条DNA链。DNA裂解发生在“NGG”相邻基序(PAM)上游的序列3个碱基对上。基因组DNA在切割后通过双链断裂(dna-dsb)修复机制修复。因此，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统通过相对容易出错的非同源末端连接(NHEJ)或高保真同源定向修复(Hdr)引入小插入或小缺失(Indels)来实现基因组修饰。
与CRISPR/Cas9一样，Cas12a(也称为Cpf1)由于其生成目标DSB的能力而被应用于基因组编辑。然而，Cas12a只需要crRNA引导就可以进行DNA靶向，它的酶识别靶区上游富含T的PAM，并在PAM远端位点切割DNA。因此，Cas12a提供了一种新的基因组编辑方法，其独特的切割机制增强和扩展了CRISPR工具包。
林萌萌老师还介绍了IDT的CRISPR 解决方案包括实验设计，CRISPR-Cas的试剂以及HDR试剂等。
朱莉老师的讲座内容主要包括：
➤ CAR-T治疗中的多色流式细胞术应用
过去十年，CAR-T治疗进展迅速，有阻碍，也有进步。CAR-T治疗效果要得到保障，流式细胞术相关的检测少不了。流式在CAR-T细胞疗法中有多种关键性的应用：
1. 血液样本免疫细胞亚型分析：抽提患者/正常人血液样本后，研究者通常会对样本中的免疫细胞亚型进行流式分析。通过细胞特异性荧光抗体与相关抗原结合，利用流式细胞仪检测荧光信号，可实现不同免疫细胞类型比例的信息展现。同时，在CAR-T回输人体后，需要检测免疫细胞亚群的比例，以评估治疗效果。
2. T细胞分选：T细胞成功分选是CAR-T治疗研究中的重要环节，可通过流式分选的方法获得纯度相对较高的T细胞。有研究报道，增加CD4+、CD8+T细胞亚群的分选流程尤为重要。通过对患者血液中细胞进行特异性荧光抗体标记，利用流式细胞仪可实现不同T细胞亚群的比例监测与分选。
3. CAR-T细胞质量检测：当CAR-T细胞构建成功并回输至活体前，需要安排动物实验以进行CAR-T细胞的效价评估，评估内容包括炎症因子检测、目的细胞亚群检测等；而当CAR-T输至人体时，同样需要检测患者血清中的细胞因子浓度，以监测预防细胞因子风暴的出现。其中，炎症相关细胞因子和趋化因子如IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-7等均是常见监测对象。
4. 细胞状态监测：目前，常见的细胞死活鉴定染料有7-AAD、PI、ZombieTM和DAPI等。SSC 和FSC无法判断所有的死细胞，同时死细胞容易和抗体结合出现假阳性，因此，加入死活染料再对T细胞进行流式分选至关重要。加入除活性染料外，检测细胞凋亡用的Annexin V检测试剂盒、Apotracker等亦能协助监测细胞的活性。当染料或探针与细胞发生作用后，释放一定强度的荧光信号，通过流式细胞仪追踪信号可判断细胞状态。
5. 转染效率检测：CAR-T细胞构造另一重要环节是转染CAR至T细胞内。转染用质粒常带有标记基因如GFP、RFP等，通过流式检测荧光信号可量化细胞的转染效率。
李涛经理的讲座内容主要包括：
➤ 细胞治疗慢病毒载体制备工艺要点
以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，加入治疗基因和标记基因可构建慢病毒载体，作为转移目的基因的载体，这一生产技术在CAR-T的生产和制备中广泛应用。
目前临床级别的慢病毒载体基本上都是通过瞬时转染293T细胞的方法生产的，但这种生产方法伴随着工艺复杂、产量较低、质量不稳定、工艺难以放大以及综合成本高等难以克服的缺陷。而慢病毒载体制备工艺要点有：
1. 四质粒系统：为了避免有复制能力病毒（RCV）的产生，在构建HIV-1型病毒载体时一般将HIV-1基因组分装于几个质粒载体中，再共转染细胞，然后获得只有一次感染能力而无复制能力的HIV-1载体颗粒。到目前为止，慢病毒载体的设计经历第一代到第三代的变迁，充分降低了同源重组产生有复制能力病毒的可能。
2. 转染方式：瞬时转染是最常用的慢病毒生产系统，这个过程中外源基因不整合到宿主染色体，能够得到短暂的高水平表达，其成本低、耗时短，适用于大量样品短时间分析，但是该过程需要大量纯化的质粒和转染试剂，而且无法长期生产得到重组蛋白。常用转染方法有聚乙烯亚胺（PEI）、磷酸钙转染和脂质体转染等。
3. 慢病毒生产工艺：包括细胞培养，病毒包装，澄清收获，浓缩换液，层析纯化与除菌过滤。基于膜分离技术和PALL一次性生物反应器与膜分离纯化产品，可实现慢病毒载体不同阶段，不同规模以及不同需求的制备与生产。结合PALL在慢病毒载体上下游工艺开发、放大方面的技术支持经验，提供上下游工艺中关键工艺点参数的筛选与优化经验分享。
CAR-T细胞疗法近年来的基础和临床研究数量突飞猛进，新技术层出不穷；其药物的开发和临床应用已经为部分肿瘤治疗带来了革命性的飞跃，但目前的靶点更多的局限于CD19抗原，且在治疗过程中患者仍会产生不可忽视的毒副作用，如细胞因子治疗综合征（CRS）和移植物抗宿主病（GVHD）等，此外CAR-T在攻克实体瘤方面还有待进一步深入研究，这些问题使CAR-T在基因治疗领域面临重大的挑战。
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