Nature Protocols：纳米红外光谱探测细胞外囊泡的结构和异质性

摘要：细胞外囊泡（EVs）是细胞主动释放的纳米级膜囊泡。最初EVs被认为是细胞碎片，并且因此被低估，但是EVs现在越来越被认为是细胞间通讯的重要介质，它们在许多生理和病理过程中发挥着重要作用。EV是异质性的，更好地了解EV的分子组成和异质性是设计下一代生物传感器以进行早期疾病诊断和开发基于EV的新兴疗法的基础，这已经在癌症诊断和治疗中显示出巨大的前景。传统的方法不具有表征单个EVs个体的分辨率和灵敏度，因此破译单个EV的结构和组成仍然是难题。

布鲁克纳米红外光谱仪（nanoIR）采用光热诱导共振技术(AFM-IR)实现微小区域红外信号的采集。红外激光照射到样品上，样品吸收辐射光产生热膨胀，这种热膨胀引发探针的震荡，通过监控探针的震荡强度获得红外吸收强度。AFM-IR利用原子力探针作为样品红外吸收的传感器，实现了超高灵敏度的光谱和红外成像探测，化学成像分辨能力可以达到10nm。近期，澳大利亚悉尼大学悉尼药学院团队将纳米红外光谱方法引入到单个EV结构的检测中，展示了其在同一EVs和不同EVs群体之间揭示个体EVs异质性的能力。此方法无标记，能够检测单个EV中的脂质，蛋白质和核酸。通过AFM-IR对EV组成和结构的新认识将有助于我们对EVs的生物学理解，并可用于疾病诊断和EVs疗法的开发。相关研究成果以High-fidelity probing of the structure and heterogeneity of extracellular vesicles by resonance-enhanced atomic force microscopy infrared spectroscopy为题，发表在Nature Protocols上。

实验内容：为了验证纳米红外具有探测不同细胞类型囊泡的分子组成的能力，作者分别从两个特征良好的hTERT转化人蜕膜（DMSC23）和绒毛膜（CMSC29）间充质基质细胞系中分离EVs，期望这两种细胞系能够产生结构和组成不同的EVs。将含有EV样品的液滴滴在基片（如ZnS, 云母或金等）干燥一晚，获得待测样品。通过分析红外光谱的峰位和峰强，可以确定DNA（1050–1290 cm⁻¹），RNA（1250–1380 cm⁻¹），蛋白质（1500–1750 cm⁻¹）和磷脂（1000–1250 cm⁻¹, 1730–1750 cm⁻¹; 2800–3000 cm⁻¹）的存在。

图2 显示了同一EV群体内不同颗粒的异质性。蓝色标记的较大囊泡的光谱表现出更强的1725 cm^-1（脂肪酸）和1240 cm^-1（磷脂）吸收，这与囊泡表面和内部的脂质和核酸数量增多相一致。表征RNA的1124 cm^-1的吸收在不同囊泡中强度不同，表明这些EVs中含有不同数量的RNA核糖。这些数据表明AFM-IR有足够的灵敏度揭示单个EVs分子组成在纳米尺度上的差异。

图3显示了CMSC29和DMSC23细胞分离的EVs亚群的AFM-IR光谱和成像。酰胺I的吸收峰在1500 cm^-1 – 1800 cm^-1范围，可归因于不同浓度和类型的核酸。

图4的数据验证了AFM-IR 表征不同细胞类型EVs的能力。DMSC23 EV具有更强的1556 cm^-1和1452 cm^-1，分别为酰胺I和脂酰CH₂基团的弯曲振动；DMSC29 EV表现出来的1124 cm^-1,1087 cm^-1,1044 cm^-1吸收则为磷脂、甘油三酯和胆固醇酯的拉伸振动，来自于EV中的脂质成分，属于核糖核酸。

总结：作者使用AFM-IR以超高分辨率探测整个EV群体，亚群和个体EV的组成和结构。实验证实纳米红外能够测量相同EV群体中，或不同EV群体之间的单个EV分子组成的细微差异。作者预测，在不久的将来，EV的AFM-IR表征极有可能释放EV作为诊断和治疗工具的全部潜力。

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原文连接：

High-fidelity probing of the structure and heterogeneity of extracellular vesicles by resonance-enhanced atomic force microscopy infrared spectroscopy[J] Nature Protocols volume 14, pages576–593 (2019) 

https://www.nature.com/articles/s41596-018-0109-3

nanoIR3/nanoIR3-s/nanoIR3-s Broadband介绍：https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers.html