血液是流动在哺乳动物的血管和心脏中的一种红色不透明黏稠液体，主要由血浆、血细胞（红细胞、白细胞）和血小板组成。其中，血浆约占血液的55%，是水、糖、脂肪、蛋白质、钾盐和钙盐的混合物。血细胞和血小板占血液的45%，其中红细胞占大多数。成熟的红细胞没有细胞核，富含红色的血红蛋白，使血液本身也呈现红色。白细胞有细胞核，可以产生抗体蛋白，帮助身体抵抗细菌、病毒和外来物质引起的感染。
血液具有运输氧气和营养物质、参与体液调节、维持体液酸碱平衡、维持体温、参与机体防御等作用。在血液中存在着参与机体免疫应答，调控相关的一类细胞，我们统称为外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell， PBMC)，包含了淋巴细胞（T细胞，B细胞和自然杀伤(NK)细胞）和单核细胞（Monocyte）。PBMC起源于位于骨髓(bone marrow)的造血干细胞( hematopoietic stem cells, HSCs)，人类的PBMC主要由淋巴细胞组成，随后是单核细胞以及一小部分树突状细胞(dendritic cells，DC)。
在外周血中，PBMC因在机体免疫中发挥了极其重要的作用而成为很多科研工作者重点关注和研究的对象。分离PBMC的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够方便地模拟体外的血液免疫环境。PBMC的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，其比重为1.070左右，而红细胞和多核白细胞的比重超过1.080。通过利用介于两者比重之间的溶液(分层液或密度梯度分离液)做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与PBMC分离，最后得到PBMC。
近年来，随着单细胞测序技术如火如荼的发展，将单细胞研究应用在血液相关样本的案例也越来越多。好的单细胞样本悬液制备可以为单细胞测序提供良好的开端，同时大大节约测序成本。吉凯精耕于科研服务领域多年，在血液样本的处理中积累了大量的实战经验，一起来看下我们是如何制备PBMC单细胞悬液的吧！
人全血 PBMC 单细胞血液制备
实验目的：
客户提供新鲜人全血样本（抗凝管保存），提取 PBMC 细胞悬液后用于单细胞测序。
实验准备：
样本接收，拍照留存，超净台紫外消毒、备好冰盒冰板，准备好生理盐水，Ficoll 试剂
实验步骤：
1. 将新鲜血液转移到 15 ml 离心管中。
2. 将离心管转移至离心机中，配平，室温 2000rpm 离心 10min。
3. 用 1ml 移液器轻轻将上层血清吸出。
4. 将上述分离血清后的血液用生理盐水按照 1:1（体积比）进行稀释，轻轻上下吹打
3-5 次混匀。
5. 将 Ficoll 试剂上下颠倒 5-10 次充分震荡混匀，将 Ficoll 试剂分装到离心管中待用
6. 将 Fcioll 加入到 15ml 离心管中（Ficoll 溶液与稀释后的血液比例为 3:4），竖直放置
到水平台面上静止备用。
7. 将稀释好的血液用移液管缓慢均匀加入到竖直放置在台面的含 Ficoll 溶液的离心管 中。保持 Ficoll 溶液与稀释后的血液比例为 3:4（体积比）。
8. 将加好血液与 Ficoll 的离心管轻轻转移至离心机中。在转移离心管过程中尽量减少晃 动，保持离心管竖直，以避免打破液面分层。室温 400×g，升降速为 1，离心 30 分钟。
9. 离心结束后分 4 层，由下到上分别为，红细胞，Ficoll 溶液，白膜层，生理盐水。
10. 用移液枪吸取一部分生理盐水，将枪头插进白膜层中小心吸取白膜层（即淋巴细胞层） 转移至新的 15 ml 离心管中。尽量避免吸取到下层或上层的细胞，避免造成污染。
11. 加入 10ml 生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，轻轻吹打混匀，100×g，10min 离心。
12. 弃上清，加入 1ml 裂红液，3min 裂红。加入清洗液终止裂红，300×g，5min 离心。
13. 加入清洗液补至体积到 10ml 清洗，100×g，8min 离心清洗细胞 2 次。
14. 弃上清，1ml 清洗液重悬，取样进行台盼蓝染色及 AOPI 计数。
部分实验结果展示：
细胞活率：99.04%
活细胞浓度：8.85E+5/ml
结团率：1.98%
细胞活率：99.18%
活细胞浓度：1.21E+6/ml
结团率：1.14%
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