分选在单细胞悬液制备中的应用（一）

随着Droplet-based单细胞测序技术的发展，单细胞测序在包括肿瘤、免疫、神经学、干细胞、发育生物学、辅助生殖等研究领域都得到了广泛的推广和应用，单细胞测序的样本来源和鉴定到的细胞类型也趋于丰富和多样化。

单细胞测序主要包括单细胞悬液制备、单细胞捕获、建库测序、生信分析等内容。“好的开始是成功的一半”，单细胞悬液制备的好坏常常是决定细胞能否上机的关键因素，但在实际送样的过程中老师们常常会遇到各种问题，比如目标细胞占比太低，单细胞测序能否捕获到？样本是坏死组织，死细胞较多，能否做单细胞测序？能否测到特定组织类型中的特性细胞类群？组织很难消化，背景总是不干净，能否做单细胞测序……工欲善其事必先利其器，针对这一系列的问题，我们都可以通过细胞分选分选+单细胞测序的方式，对组织量少、目标细胞占比低、组织样本有坏死、细胞少间质多、组织难消化、关注特定类型细胞群等样本进行分选富集，分选出客户需要的特定细胞类群，制备合格的单细胞上机悬液，最大限度的节约测序成本。

细胞活率高，背景干净无杂质的单细胞悬液是得到一份高质量单测数据的必要条件，当细胞悬液背景内存在大量碎片或死细胞时，其释放出的RNA片段可能也会被捕获，同时会对正常活细胞的捕获带来干扰，造成背景信号较高，进而导致可有效利用的数据减少。在活细胞总量足够的情况下，通过分选去除碎片和死细胞，保留活细胞，可以最大限度的保证测序数据的质量和利用率。在单测的文献中，通过分选去除死细胞及碎片也比较常见，如Kim等（Kim. et al., 2020）在对DiHS/DRESS患者的皮肤和血液进行单细胞测序的过程中，对皮肤组织进行解离之后就通过流式分选来保留样本中的活细胞，之后再进行后续的文库构建、测序和数据分析等工作。

吉凯在活细胞富集分选中也具有比较多的项目经验，对于一些消化后本身杂质或碎片等较多的样本，流式分选去除碎片和死细胞可以大幅提高单细胞悬液的背景清晰度，进而提高测序质量。

细胞是执行生命功能的基本单位，单细胞测序最重要的结果之一便是可以通过测序及鉴定获得某一样本中所包含的所有细胞类型。然而，现有的主流单测平台在细胞捕获过程中均有一定的捕获效率，同时不同样本的细胞活力有所区别，而同一样本中的不同类型细胞活力也并不均衡，这就导致当样本中某种类型的细胞占比较低时，就有捕获不到的风险。如果这类占比较低的细胞比较受关注，理论上可以通过加大总细胞捕获量来增加低占比细胞被捕获的概率。细胞的鉴定主要是通过marker 基因的表达，在增加细胞捕获数的同时，为了保证细胞能被鉴定，就需要同时增加测序数据量，保证测序深度，这种方式既造成了样本组织量的浪费，也会大幅增加测序成本。而如果通过分选的方式对目的细胞进行富集后上机测序，则可以在节约测序成本的同时保证目的细胞的捕获。

Nguyen等(Nguyen.et.al., 2018)对人乳腺进行单细胞测序的过程中，在对目标组织进行解离后，通过CD45-EpCAM+CD31- 结合活细胞染料标记的方式对上皮细胞进行了特定的分选，保证了目标细胞群的捕获并鉴定出了三种不同的上皮细胞群存在，包括1种基底细胞和2种管腔细胞。

吉凯可协助客户针对占比较低的目的细胞群进行特定分选方案的设计和分选。在过往项目中，客户样本解离后经流式初步检测，目标细胞群占总内皮细胞0.3%，占总细胞比例预计仅占0.02%。吉凯结合老师的目标细胞群特点，通过磁珠+流式分选相结合的方式，帮助客户利用最少的初始样本尽可能的分选到足够上机的目标细胞群体，最终数据分析显示大部分细胞是目标细胞，共检测到细胞3200，目标细胞2500左右。

流式分选检测

数据分析显示分选后目的细胞占比极大提高

对于单细胞测序而言，测序成本主要来自于建库和测序的数据量。常规样本一般采用3000-5000个细胞，100G的数据量，或者8000-10000个细胞，200G的数据量进行测序，基本可以保证30-50k reads/cell，保证细胞大部分基因都可以被测到。若客户关注某些特殊细胞类群，那么通过分选出目的细胞类群后再测序的方式，则可以极大地节约测序成本，避免不必要的数据浪费。

不同组织中的内皮细胞具有异质性，Kalucka等（Kalucka et al., 2020）在分析小鼠内皮细胞过程中，对11个组织分别解离后，通过活细胞染料结合CD45-EpCAM-CD31+ 流式分选来富集目标内皮细胞，最后仅通过32000个单细胞转录组数据集鉴定出78个内皮细胞亚群，揭示了不同组织中内皮细胞的相似性和异质性。

本期对细胞分选在单测中的适用场景介绍就到这里，下一期小编带大家继续了解常见的分选方式及其应用，小伙伴们，下期不见不散哦！

【参考文献】

Kim. et al., 2020. Targeted therapy guided by single-cell transcriptomic analysis in drug-induced hypersensitivity syndrome/drug reaction with eosinophilia and systemic symptoms: A case report. Nat Med.

Nguyen.et al., 2018. Profiling human breast epithelial cells using single cell RNA sequencing identifies cell diversity. Nature Communications.

Kalucka et al., 2020. Single-Cell Transcriptome Atlas of Murine Endothelial Cells. Cell.