综述解读丨一文了解肾脏疾病的蛋白组和代谢组研究进展和挑战

迈维代谢

2022.6.17

作者迈维代谢

TA的动态

01摘要

在蛋白质组学和代谢组学在肾脏疾病研究中的应用综述中，作者回顾了关键概念，强调了例证，并概述了未来的方向。蛋白质组和代谢组学除了反映遗传编码外，还反映了环境暴露的影响。蛋白质和代谢产物的循环水平是动态的和可改变的，因此易于靶向治疗。蛋白质组学和代谢组学研究中的设计和分析考虑事项应符合研究者的目标。

为了识别临床生物标志物，需要调整所有潜在的混杂变量，特别是GFR和严格的显著性阈值。然而，鉴于蛋白质组和代谢组内的高度相互关联，这种方法有可能使生物信号变得模糊，并且可能过于保守。质谱分析通常与前沿色谱分离技术相结合，是蛋白质组学和代谢组学的主要研究方向。

基于抗体和适体的高通量蛋白质组平台已成为分析蛋白质组的额外、强大方法。随着这些方法覆盖范围的不断扩大，机器学习工具和途径分析可以帮助选择最感兴趣的分子，并按照不同的生物学功能对其进行分类。到目前为止的研究已经取得了实质性的效果，例如阐明膜性肾病中的靶抗原，识别在CKD中为尿白蛋白提供预后信息的尿多肽，说明循环炎症蛋白是糖尿病肾病的潜在介质，证明微生物组在尿毒症环境中的关键作用，以及强调肾生物能量学在AKI中是一个可改变的因素。还需要额外的研究来在独立队列中复制和扩展这些发现。

此外，还需要做更多的工作来了解选定的蛋白质和代谢项目标记物的纵向轨迹，在合并的数据集中进行基因组分析，并纳入更多基于肾脏组织的研究。

背景介绍

我们在分析大量患者群体中约30亿个人类基因组DNA碱基对(或基因组信息子集)的能力方面取得了巨大进展，对我们理解肾脏疾病病理生理学、风险预测和治疗具有级联效应。通过询问基因组下游的分子结构域，蛋白质组学和代谢组学有可能在这些进展的基础上再接再厉，并增加新的见解。

由于蛋白质组和代谢组学代表了基因功能的总和效应，因此它们有时被归入“功能基因组学”的总体领域，该领域的目标是在全基因组范围内理解基因型和表型之间的关系。所有这些“组学”方法都包含对人类健康和疾病的较全面检测，但分析方法可能存在很大差异。此外，尽管对大数据集(无论分子类型如何)有共同的分析方法，但在概念和操作方面也存在分歧。

肾脏疾病代谢组学和蛋白质组学的关键概念

生物系统中信息的基本流动是从DNA(基因组)到RNA(转录组)到蛋白质(蛋白质组)到代谢产物(代谢组学)(图1)。尽管体细胞突变肯定会发生(并且在癌症中至关重要)，但从肾病的角度来看，DNA序列在很大程度上可以被视为在整个身体中是静态和一致的。因此，肾脏基因组评估不需要对肾脏DNA进行测序，而是可以从任何其他来源的DNA分析中推断出来。

相比之下，蛋白质组和代谢组学是高度动态的——事实上，这是为什么检查这些结构域对于理解基因组的“功能”后果至关重要的一个主要原因。此外，整个身体的蛋白质组和代谢组学不同，因此对肝脏、肌肉、肾脏、血液、尿液等进行蛋白质组学或代谢组学分析。将产生不同的结果。组织内也存在异质性，例如肾脏中的肾小球、内皮和肾小管细胞之间存在异质性。因此，检查蛋白质组和代谢组学有明显的优势:与基因组相比，蛋白质组和代谢组学在特定的时间和地点提供生物学信息，更接近疾病表型。

此外，两者均可应用于血液和尿液，生物流体是临床肾脏病当前诊断和预后方法的核心——事实上，代谢产物(如尿素、肌酐、葡萄糖和尿酸)以及蛋白质(如白蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、补体和甲状旁腺激素)对于专业肾脏病学家来说是不可或缺的。或许最重要的是，蛋白质和代谢产物是可修饰的，因此可以靶向治疗。

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图1 蛋白质组和代谢组及其上游对应组之间的概念关系

尽管蛋白质组学和代谢组学有一些独特的优势，但它们相对于基因组学有一个明显的缺点——无法推断因果关系，例如当观察到特定蛋白质或代谢产物与疾病之间的关联时。在基因组学中，无论是对于孟德尔病还是对疾病风险有多基因贡献的更复杂的疾病，DNA序列中的种系变化顾名思义先于疾病发作。全基因组关联研究可能表明，疾病与功能不确定的单核苷酸多态性有关，其中大部分是非编码和/或内含子的；尽管这些研究不能精确定位驱动关联的确切遗传改变，但是它们仍然暗示了由单核苷酸多态性标记的特定基因组区域在疾病发病机理中。重要的是，需要随后的实验工作来证明由基因组分析产生的因果推断；然而，种系基因型和发病之间的时间关系是单向的。相比之下，蛋白质组和代谢组的动态性质意味着影响方向(即来自蛋白质/代谢产物↓→疾病)可能难以辨别。

在任何蛋白质组学或代谢组学研究中，都需要仔细解决混杂因素。在蛋白质组学(尤其是尿液分析)中，解释蛋白尿的潜在差异至关重要，因为尿液中的蛋白表型可能反映肾脏中的特定生物过程，或仅是非特异性地通过受损的肾小球过滤屏障。在代谢组学中，考虑到胰岛素对全身代谢和血液代谢组的广泛作用，在样本采集时考虑体重指数、糖尿病和空腹状态的差异至关重要。蛋白质组和代谢组学也受年龄、性别、饮食和昼夜变化的影响，尽管我们对这些相互作用的理解是不完整的。

在将蛋白质组学和代谢组学应用于肾脏疾病时，GFR可能比任何其他潜在的混杂因素更需要深思熟虑。图2显示了从10名受试者的主动脉(A)和肾静脉(V)采集的血液的蛋白质组学和代谢组学分析结果。肌酐和胱抑素C分别作为GFR的代谢产物和蛋白指标突出显示。除了主要在脂蛋白中循环的脂质代谢产物之外，大多数血液代谢产物都会经历一定程度的肾脏清除——因为它们体积小且呈极性，许多可能会经历肾小球滤过，但其他代谢产物也会在器官内经历肾小管净分泌或代谢，正如我们之前针对相对A-V减少量大于肌酐的选定代谢产物所显示的那样。由于其较大，大部分循环蛋白未经历肾小球滤过，且本分析中的大部分蛋白质组未显示显著的A-V减少。但也有明显的例外情况，包括已知会经历一些肾脏清除的蛋白质，如B2-微球蛋白和甲状旁腺激素。一些代谢产物和蛋白质也表现出A-V增加，增加了从肾脏净释放的可能性。

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图2 循环代谢组和蛋白质组的肾动静脉梯度

在考虑肾功能对蛋白质组和代谢组的影响时，还必须了解在统计分析中调整GFR的局限性。一方面，GFR(即使直接测量)不能说明肾功能的全部范围，如肾小管的吸收或分泌。因此，调整GFR并不排除潜在肾脏健康差异引起的残留混杂。同时，针对GFR进行调整可能会使有生物学意义的信号变得模糊。例如，一种分子可能与GFR呈负相关，因为它具有肾毒性，会导致GFR下降。循环蛋白质比代谢产物更有可能出现这种可能性，因为蛋白质组包含了广泛的生物领域，包括炎症、血栓形成、代谢、细胞生长和分化等。循环酶、细胞因子和激素都是疾病发病机制中有吸引力的潜在参与者。值得注意的是，最近的研究已经开始为选定的循环代谢产物分配未预期的功能角色，有时通过先前“孤儿”的G蛋白偶联受体发挥作用。这些发现中有许多似乎围绕肠道微生物与宿主免疫和代谢的相互作用而锚定；考虑到它们与炎症、BP和能量利用的相关性，该亚群中的代谢产物是肾病及其并发症的潜在因果介质。

测定方法学

尽管核酸包含4至5个相似的化学基序，但蛋白质和代谢产物的大小、极性和结构范围广泛，给分析带来了相当大的挑战。有关蛋白质组学和代谢组学方法的详细综述，请读者参阅其他深入综述。质谱以质荷比为基础区分离子(例如肽片段或代谢产物)，是蛋白质组学和代谢组学的主要研究方向。

通常，质谱与前置分离技术(如液相色谱或气相色谱)相结合，这对最终测量分析物有很大影响。双向凝胶电泳也已广泛应用于蛋白质组学，而核磁共振光谱法已成为代谢组学的一种重要替代方法。对于质谱，分析前需要将蛋白质酶促消化为多个较小的肽和肽片段。这种对复杂的分析前样本制备的要求在历史上限制了基于质谱的蛋白质组学的通量。最近，开发了捕获和检测数百或数千种蛋白质的高度多重化方法。使用核苷酸标记的抗体或适体(基于核酸)实现特异性蛋白质捕获，然后基于核酸寡聚化进行检测和定量。这些方法的广度、灵敏度和通量使其成为强大的研究工具，可应用于大量研究人群。

对于蛋白质组学和代谢组学来说，分析验证都很重要。例如蛋白质的ELISA或代谢产物的串联质谱。由于蛋白质组学和代谢组学方法通常提供关于相对蛋白质或代谢产物水平的信息，而不是绝对浓度，因此也可能需要进行绝对定量。

关键分析的思考

与基因组学一样，在蛋白质组学和代谢组学中需要校正多重假设检验，以降低错误发现的风险。然而，没有类似于P<5x10-8全基因组阈值的统一应用的阈值，部分原因是蛋白质组和代谢组的实际大小是不确定的(取决于是否包括翻译后修饰、异生素等)和不同的平台提供了这些分子域的不完全和仅部分重叠的覆盖。后一种限制使得在蛋白质组学和代谢组学中跨组群的独立复制和荟萃分析比基因组学更具挑战性。对于发现分析，大多数研究者倾向于使用Bonferroni调整或错误发现率，例如使用Benjamin-hochBerg程序。然而，考虑到许多分析物在生物途径中的相互关系，这些方法可能过于保守，并且与GFR的调整一样，有可能模糊生物信号。如果目标是识别出与其他已建立的预测因子有显著相关性的单个生物标志物，那么完全调整的模型和严格的显著性阈值是理想的。对生物发现的关注可以保证更大的灵活性(图3)。

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图3 人类蛋白质组学和代谢组学研究中常用分析方法概述

机器学习和通路分析是帮助组织和解码组学数据集的有效方法。最小绝对收缩选择算子、弹性网、随机森林回归等机器学习方法各有所长。在组学数据集中，许多变量可能是共线的，随机森林回归可能比其他方法更好地处理这一点。如果目标是建立一个简约的风险模型，最小绝对收缩和选择算子或弹性网可能更合适。支持向量机或聚类是在有监督或无监督的机器学习中使用算法对变量进行分类的方法。这些方法可以调整，以选择适合研究目标的“热门”数量。当设计生物标志物风险小panel时，少数热门可能是理想的，而数百种蛋白质或代谢产物将更适合通路分析。通路分析是一个宽泛的术语，包括几种将大数据集组织成功能不同的生物的方法。这些方法比代谢组学更成熟，在蛋白质组学(和基因组学)中的应用也更广泛。有许多可用于通路分析的公开软件程序，包括基因集富集分析；用于注释、可视化和集成发现的数据库；和检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具。独创性途径分析也被广泛使用，并且需要私人许可。

文献中的例证

1.蛋白质组学在理解膜性肾病生物学中的应用

M型磷脂酶A(2)受体(PLA2R)的故事说明了蛋白质组学发现为病理生物学提供信息并指导诊断和治疗的潜力。根据其组织病理学，原发性膜性肾病长期被认为是一种抗体介导的自身免疫性肾小球疾病，但其靶抗原未知。Beck等人用来自原发性膜性肾病和继发性膜性肾病患者及正常对照者的血清对正常人肾小球的蛋白提取物进行了westernblots。研究者鉴定了原发性膜性肾病特异性的185kDa反应蛋白条带，然后对该反应蛋白条带应用LC-MS检测PLA2R。此外，他们还发现PLA2R在健康肾脏的足细胞中表达，并且在原发性膜性肾病患者的肾小球免疫沉积物中发现了针对PLA2R的抗体。在一些抗PLA2R阴性膜性肾病患者中，使用类似方法(westernblotting，然后LC-MS)鉴定含血小板反应蛋白1型结构域7A(THSD7A)作为自身抗体的附加靶抗原。自这些具有里程碑意义的发现以来，已发现PLA2R自身抗体约占原发性膜性肾病病例的70%~80%，THSD7A自身抗体占小得多的比例。这些发现改变了临床治疗，因为发现血清自身抗体水平与膜性肾病的活动性和对免疫抑制的反应相关。最近的一项探索性研究将基于LC-MS的蛋白质组学应用于接受钙调神经磷酸酶抑制剂治疗或未接受钙调神经磷酸酶抑制剂治疗的特发性膜性肾病患者的血清，并确定血清淀粉样蛋白A1为候选标志物，除PLA2R抗体水平外，还可提供进一步的预后信息。

2.蛋白质组学在预测CKD发病率和预后中的应用

膜性肾病的例子说明了蛋白质组学发现如何集中于一种或两种特定蛋白质，而其他研究则考虑了更广泛的分子。Mischak和他的同事认可了将多种肽或蛋白质生物标志物结合的价值，前提是单一生物标志物的高可变性限制了准确性。使用毛细管电泳法，这些研究人员比较了230例CKD病因患者和379例肾功能正常对照者的尿液。采用支持向量机聚类分析，将CKD与健康对照之间存在差异的273种尿肽合并为一种称为CKD273的尿肽标记物。包括数千例患者样本的后续研究显示，CKD273在CKD检测和预测方面的效用可能高于标准度量。美国食品药品监督管理局发布了一份支持函，鼓励在早期临床试验中将CKD273作为生物标志物组进行进一步研究，“以确定其在预后、药物开发决策和研究设计方面的临床实用性”，但也注意到CKD273在预测更晚期疾病患者进展为ESKD或血清肌酸酐翻倍方面表现不佳。

CKD273的主要成分包括胶原蛋白片段(可能表明肾内细胞外基质积聚)，以及参与炎症和组织修复的血液衍生蛋白片段。值得注意的是，慢性炎症作为糖尿病肾病进展的风险标志物和潜在病因引起了相当大的兴趣。例如，Niewczas及其同事强调了循环TNF受体1和2(TNF-R1和TNF-R2)与糖尿病肾病中ESKD风险之间的强关联。为了更全面地评估糖尿病肾病中的炎症，这些研究人员最近使用了一种基于适体的方法来测量一组194种蛋白，其中包括文献中已知的大多数循环炎症蛋白和之前在糖尿病肾病中研究的大多数蛋白。对来自Joslin肾脏研究的219名1型糖尿病受试者进行了发现分析，随后对来自Joslin肾脏研究的144名二型糖尿病受试者进行了验证，并对来自PimaIndian研究的162名二型糖尿病受试者进行了复制。本研究确定了肾脏风险炎性信号(KRIS)，由17种富含TNF-R超家族成员的炎性蛋白组成，与ESKD的10年风险显著相关。研究者还从GFR快速下降的小病例对照分析中评估了尿中的KRIS蛋白，发现大多数病例中KRIS蛋白升高，没有降低。此外，他们在从56名印度人获得的肾活检标本中发现，大多数循环KRIS蛋白水平与其相应的基因表达之间没有显著相关性。基于这些观察结果，作者认为非肾脏来源(如白细胞)在产生循环KRIS蛋白中起重要作用，可能是糖尿病肾病的病因驱动因素。

3.代谢组学及肠道菌群对尿毒症的贡献

许多代谢组学研究检测血液或尿液，目的是确定与CKD相关的代谢产物改变或确定CKD进展的代谢产物预测因子。迄今为止，尚无单一代谢产物成为CKD或其并发症发病机制中的明确因果因素；这部分与上述跨平台的非重叠和研究人群的异质性有关，但也与代谢组学紊乱的绝对数量有关，代谢组学紊乱表现为肾脏清除能力丧失。然而，出现的一个主要主题是肠道微生物群对CKD血液代谢组学的贡献。例如，Meyer及其同事使用LC-MS分析了9例结肠完整的血液透析患者和6例既往接受过结肠切除术的血液透析患者的血样。与结肠完整的ESKD患者相比，接受结肠切除术的ESKD患者至少35种代谢产物(包括硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚)的水平明显较低。重要的是，ESKD患者中这些结肠源性代谢产物的水平显著高于肾功能正常的个体，且大多数未通过常规血液透析有效清除。Abe和他的同事对硫酸苯酯(一种来源于肠道微生物的酪氨酸代谢产物)作为糖尿病肾病的潜在致病因素产生了特别的兴趣。在糖尿病患者中，他们发现硫酸苯基酯水平与蛋白尿相关，此外，硫酸苯基酯给药和对负责其合成细菌酶的抑制分别诱导和改善小鼠的蛋白尿。

Hazen和他的同事们将注意力集中在一种特定的肠道代谢产物，三甲胺-N-氧化物(TMAO)上，认为它是心血管疾病的潜在致病因素。对TMAO的最初兴趣源于对流行性心血管疾病患者血样的代谢组学分析，随后的研究表明TMAO升高与新发心血管事件相关。使用抗生素抑制肠道菌群前后的研究证明了血液TMAO对肠道菌群的影响，并基于TMAO抑制胆固醇反向转运、增加血小板高反应性和促进巨噬细胞泡沫细胞形成的能力，确定了其在动脉粥样硬化形成中的作用。在小鼠中，膳食TMAO负荷也可导致肾小管损伤和肾纤维化。由于TMAO主要通过肾脏排泄，并且随着CKD水平升高，几个研究组检查了CKD和ESKD患者中其与心血管疾病的相关性，结果喜忧参半。无论硫酸苯酯和TMAO等分子是否被证明是CKD的重要致病因素，这些研究都强调了代谢组学整合内源性和外源性输出的能力，后者包括饮食和微生物群的贡献。

4.代谢组学在转化型AKI研究中的应用

Parikh和他的同事应用基于LC-MS的代谢组学，检查过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活剂1-α功能丧失和获得小鼠的内源性肾脏代谢，他们已经表明这些小鼠分别对AKI具有致敏作用和保护作用。他们发现PGC1a缺陷动物的肾脏中烟酰胺水平较低，烟酰胺水平随着AKI而下降。相比之下，烟酰胺水平在转基因PGC1a动物中较高，烟酰胺补充在不同损伤模型中具有肾保护作用，部分原因是挽救了AKI诱导的脂代谢损伤。烟酰胺是NAD+补救途径中的前体，NAD+是能量代谢的重要辅因子，是一系列组织中细胞健康的关键决定因素。Parikh和他的同事证明，表明从头NAD+生物合成减少的尿代谢产物与人类AKI风险相关，此外，还生成了试点数据，提高了口服烟酰胺补充剂强化NAD+可能减轻心脏手术中肾损伤的可能性。许多代谢物容易在体内递送，并且它们的同源酶、转运体和受体都是小分子激动或拮抗作用的潜在靶点。

未来方向

尽管已经取得了一定的进展，但要充分发挥蛋白质组学和代谢组学在肾脏疾病研究中的潜力，还需要做更多的工作。例如，美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(NIDDK)CKD生物标志物联合组织(www.ckdbiomarkersconsortium.org)正在积极生成超过3000名CKD患者的血液蛋白质组和代谢组学数据，这些患者跨越多个不同的研究队列，包括成人和儿童。除了与以前的CKD研究相比提高统计能力之外，这种协同努力还将能够检测不同的结果，如CKD进展、心血管事件和认知发育，以及不同的“亚表型”，即在诊断、合并症或其他鉴别特征的基础上观察患者亚群。由于一些蛋白质组学和代谢组学数据将在已进行基因分型的通用样本集中生成，因此也存在进行综合分析的机会；对于血液蛋白质组或代谢组的全基因组关联研究存在范例，而整合蛋白质组和代谢组的努力较少开发。

即使肾脏疾病的蛋白质组学和代谢组学研究继续扩大，重要的机会仍然存在。迄今为止，大队列中显示蛋白质组和代谢组纵向轨迹的重复测量数据相对缺乏。此外，蛋白质组和代谢组的空间异质性意味着血液或尿液检查仅提供了有限的器官内生物学信息。NIDDK肾脏精确药物项目(www.kpmp.org)预计将为生物标志物研究提供急需的人类肾脏组织，该项目和模型系统中更具机理的研究对于确定肾脏疾病中所选蛋白质或代谢产物发生改变的原因以及它们是否在疾病发病机制中发挥因果作用至关重要。蛋白质翻译后修饰鉴定的最新进展将增强我们对肾脏疾病蛋白质组的理解。同时，基因组学与蛋白质组学和代谢组学的整合可能允许使用基于孟德尔随机分配的方法来检测所选标记是否位于因果路径中。这些努力将需要各学科之间的大力合作，并将在肾病学研究中基因组发现势头的基础上进一步推进我们对肾病的理解和治疗方法。