Nature 子刊 CDD∣山东大学研究团队发现Wnt/β-catenin信号通过靶向GPX4抑制胃癌细胞铁死亡发生

胃癌是世界范围内最常见的癌症之一，在全球癌症发病率中排名第五，死亡率中排名第四。幽门螺杆菌感染是公认的胃癌诱因之一，在慢性浅表性胃炎-萎缩性胃炎伴肠化生-不典型增生-胃癌这个发展过程中发挥了重要作用。Wnt/β-catenin信号通路是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路，在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生等生理过程中具有至关重要的作用。铁死亡是近年来发现的一种新型程序性细胞死亡方式，与多种肿瘤的发生、发展密切相关，目前对于Wnt/β-catenin信号通路与铁死亡之间的关系尚没有研究。

日前，山东大学贾继辉教授研究团队在《Cell Death & Differentiation》（2021 IF:15.828）在线发表了题为“Wnt/beta-catenin signaling confers ferroptosis resistance by targeting GPX4 in gastric cancer”的研究结果。该研究探究了在幽门螺杆菌感染的过程中Wnt/β-catenin信号通路与铁死亡之间的关系，阐明幽门螺杆菌激活Wnt/β-catenin信号通路调控铁死亡在胃部恶性转化中的作用机制，为增强肿瘤的化疗敏感性提供新策略。

为了研究Wnt/β-catenin信号通路与铁死亡之间的关系，研究者使用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂LF3分别联合铁死亡诱导剂Erastin、自噬诱导剂Actinomycin D、坏死性凋亡诱导剂TNF-α处理胃癌细胞系，发现LF3选择性增强了胃癌细胞对Erastin诱导的细胞铁死亡的敏感性，但是却不影响胃癌细胞对Actinomycin D诱导的自噬、TNF-α诱导的坏死性凋亡的敏感性。随后，研究者检测了抑制Wnt/β-catenin信号通路后脂质活性氧及脂质过氧化产物的变化情况，发现与对照组相比，在LF3联合Erastin处理组中MDA、4-HNE和脂质活性氧的含量显著增加。

图1. 抑制Wnt/β-catenin信号通路可特异性增强胃癌细胞对铁死亡的敏感性

当Wnt信号通路被激活时，β-catenin进入细胞核，与转录因子TCF/LEF结合，促进Wnt信号通路靶基因的转录，TCF4是Wnt/β-catenin信号通路中发挥主要作用的转录因子。为了进一步探究TCF4是否在铁死亡中发挥作用，研究者构建了TCF4基因敲除的三种胃癌细胞系。TCF4的缺失增强了胃癌细胞对Erstatin诱导的铁死亡的敏感性。TCF4敲除引起的细胞死亡可以被铁死亡抑制剂ferrostatin-1和liproxstatin-1回复，但是无法被凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、坏死性凋亡抑制剂necrosulfonamide或自噬抑制剂3-methyladenine回复。随后我们在胃癌细胞中过表达TCF4，观察到TCF4可显著抑制由Erastin诱导的铁死亡的发生。此外，TCF4敲除的胃癌细胞中脂质过氧化指标MDA和4-HNE的生成增加，而过表达TCF4能够降低MDA和4-HNE的生成。

图2. Wnt信号通路中的关键转录因子TCF4抑制胃癌细胞铁死亡

ChIP-seq结果显示，在胃癌细胞中，TCF4能够与1026个基因的启动子区结合，其中有5个基因属于铁死亡相关基因。随后研究者在胃癌细胞系中敲低TCF4，使用RT-PCR检测了可能被TCF4调控的5个铁死亡相关基因的表达，发现GPX4的表达下降最明显。为了证明TCF4通过GPX4调控胃癌细胞铁死亡，研究者构建了GPX4基因敲除的胃癌细胞系，并分别在对照细胞与GPX4-KO细胞中过表达TCF4，检测脂质过氧化产物MDA的水平与胃癌细胞的集落形成能力。结果显示，过表达TCF4能够降低胃癌细胞脂质过氧化水平，增强胃癌细胞集落形成的能力；而在GPX4被敲除的情况下，过表达TCF4对胃癌细胞铁死亡的影响得到回复。

图3. TCF4通过调控GPX4进而抑制胃癌细胞铁死亡

接下来研究者进一步对TCF4调控GPX4的具体结合位点及β-catenin/TCF4转录复合体调控GPX4的方式进行了研究。以往的研究显示，TCF4通过“CAAAG”这段保守的结合基序调控其靶基因的转录。研究者通过UCSC网站找到GPX4转录起始位点前3000bp的基因序列，并发现其中包括4段TCF4的保守结合基序，于是我们构建了包含这四段结合位点的双荧光素酶报告基因质粒，敲低TCF4时WT4质粒的双荧光素酶活性降低；过表达TCF4时WT4质粒的双荧光素酶活性升高。随后研究者构建了WT4双荧光素酶报告质粒的突变体，敲低或过表达TCF4时突变型双荧光素酶质粒的活性并没有变化。染色质免疫共沉淀实验的结果也证实，TCF4可以与GPX4的启动子区直接结合。

由于在Wnt/β-catenin信号通路激活过程中，β-catenin需要从细胞质转位进入细胞核并与TCF4结合，从而激活下游靶基因转录，因此接下来研究者想探究β-catenin是否参与TCF4对GPX4的调控过程。敲低β-catenin后， GPX4的mRNA和蛋白表达明显降低。随后使用Wnt信号通路抑制剂LF3抑制β-catenin与TCF4结合的前提下过表达TCF4，发现由TCF4过表达所诱导的GPX4的mRNA水平与蛋白水平的升高均被LF3所抑制。

接下来研究者分别在对照与TCF4敲除的胃癌细胞中过表达β-catenin，结果显示，在TCF4敲除的胃癌细胞中过表达β-catenin时，GPX4的表达升高被回复。随后，研究者构建了一个TCF4过表达质粒的突变体，将β-catenin与TCF4结合的位点进行了突变，结果显示，转染TCF4野生型质粒后能够在mRNA水平和蛋白水平将TCF4敲除引起的GPX4的表达降低完全回复，但是转染TCF4突变型质粒后GPX4的表达没有回复。

图4. β-catenin/TCF4以转录复合体的形式直接结合在GPX4的启动子区调控其转录

顺铂可以增加胃癌细胞脂质过氧化水平并诱导胃癌细胞发生铁死亡。敲除TCF4后，胃癌细胞对于顺铂的敏感性增强；过表达TCF4的胃癌细胞对于顺铂的敏感性降低。顺铂处理的胃癌细胞系4-HNE水平较对照组升高，顺铂处理的TCF4敲除胃癌细胞系4-HNE水平进一步升高；而过表达TCF4后能够使顺铂导致的4-HNE水平的升高得到一定程度的回复。因此，顺铂可上调胃癌细胞脂质过氧化水平进而导致铁死亡，TCF4在胃癌中表达升高导致胃癌细胞对顺铂耐药，抑制TCF4可增强胃癌细胞对顺铂的敏感性。

图5. 体外抑制TCF4可增强胃癌细胞对顺铂的敏感性

与单纯使用顺铂治疗相比，在敲除TCF4的基础上联合使用顺铂可以有效增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性，缩小肿瘤的重量与体积。发现敲除TCF4后GPX4的表达降低，而使用顺铂并不影响GPX4的表达。另外，使用顺铂或TCF4敲除能够增加瘤体脂质过氧化水平，而在TCF4敲除的基础上使用顺铂能够进一步引起瘤体的脂质过氧化水平升高。考虑到基因敲除在临床应用推广方面的不成熟及局限性，因此接下来研究者在体内对Wnt信号通路抑制剂LF3的功能做进一步的研究。结果显示，使用了LF3的基础上联合使用顺铂能够进一步增强药物对肿瘤的杀伤作用，缩小肿瘤的体积与重量。腹腔注射LF3或顺铂组的小鼠肿瘤脂质过氧化水平均有一定程度的升高，LF3联合顺铂组的脂质过氧化水平在此基础上又有进一步的升高。

图6. 体内抑制Wnt信号通路可以增强肿瘤对顺铂的敏感性

幽门螺杆菌感染胃癌细胞后可降低细胞内的MDA及脂质活性氧水平。另外，细胞内还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例随着幽门螺杆菌感染的浓度升高而呈梯度升高的变化趋势。TCF4与GPX4的mRNA与蛋白水平随着感染时间的延长和感染浓度的升高而呈现梯度升高的趋势。幽门螺杆菌灌胃的小鼠胃部免疫组化染色结果显示，灌胃组小鼠胃腺体中TCF4、GPX4的表达均明显升高，且TCF4主要表达于细胞核内，GPX4主要表达与细胞质中，与先前的研究结果一致。胃镜获取的幽门螺杆菌阴性与阳性的人胃炎标本中TCF4与GPX4的表达均明显较幽门螺杆菌阴性的胃炎标本升高。接下来研究者用幽门螺杆菌感染TCF4基因敲除的胃癌细胞系，检测发现幽门螺杆菌感染能够在mRNA与蛋白水平上调GPX4的表达，而敲除了TCF4后，幽门螺杆菌感染无法引起GPX4在mRNA水平与蛋白水平的表达改变。

图7. 幽门螺杆菌感染可通过TCF4上调GPX4的表达

该研究发现，幽门螺杆菌能够激活Wnt/β-catenin信号通路，上调转录因子TCF4的表达，进而通过β-catenin/TCF4转录复合体促进GPX4的转录，从而抑制胃癌细胞的脂质过氧化水平，抑制由化疗介导的铁死亡的发生。通过使用抑制剂或敲除TCF4，靶向Wnt/β-catenin信号通路，可以抑制铁死亡核心基因GPX4的表达，促进胃癌细胞对化疗诱导的铁死亡的敏感性。该研究为铁死亡的转录调控提供了一种新机制，也为增强顺铂等化疗药物的疗效提供了一种新途径。

该研究中使用的TCF4质粒（GV657）、TCF4和GPX4 CRISPR-Cas9 敲除慢病毒均由吉凯基因提供。

山东大学基础医学院贾继辉教授和曾季平教授为本文通讯作者。山东大学基础医学院王越博士为本文第一作者。