【青莲客户文章】北京协和医院发现双重靶向N-糖基化和铁死亡的胰腺导管癌创新治疗策略

胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是一种致死性很强的恶性肿瘤，部分原因是由于蛋白质糖基化异常引起的病理性改变重塑了PDAC细胞的分子生物学过程，保护PDAC细胞免于死亡。脂质过氧化导致的铁死亡是PDAC的靶向脆弱点。然而，糖基化和铁死亡之间的相互作用仍不清楚。

近日，青莲百奥合作客户北京协和医院陈杰教授团队在《Cell Death and Differentiation》（IF=12.4）期刊上发表了题为“ Targeting N-glycosylation of 4F2hc mediated by glycosyltransferase B3GNT3 sensitizes ferroptosis of pancreatic ductal adenocarcinoma”的研究文章。该研究揭示了4F2hc的N-糖基化在铁死亡中以前未被认可的功能，并表明双重靶向N-糖基化和铁死亡可能是PDAC的创新治疗策略。青莲百奥为该项目提供蛋白质糖基化组学检测、转录组测序和多组学分析服务。

【文章标题】Targeting N-glycosylation of 4F2hc mediated by glycosyltransferase B3GNT3 sensitizes ferroptosis of pancreatic ductal adenocarcinoma

【发表期刊】Cell Death and Differentiation（IF=12.4）

【发表时间】2023.07

研究背景

在胰腺癌症的组织学亚型中，PDAC（胰腺导管腺癌）是最常见的外分泌肿瘤，也是最常见的胰腺癌，占胰腺癌的90%以上。有证据表明，在胰腺恶性肿瘤，包括胰腺导管腺癌（PDAC）中，蛋白糖基化异常在细胞死亡逃逸、持续增殖信号传导和化疗耐药性中起关键作用。铁死亡是一种新型的调节细胞死亡形式，是抗癌治疗潜在的干预靶点。糖基化和铁死亡都是生理代谢过程，为癌症治疗提供新的治疗机会。然而，糖基化和铁死亡之间的关系尚未得到很大程度的揭示。

研究思路

本研究通过N-/O-糖基化蛋白质组学和RNA-Seq研究揭示PDAC细胞经RSL3诱导铁死亡的糖蛋白质组学和转录组特征，证明在PDAC细胞铁死亡期间，N-糖基化的4F2hc和糖基转移酶B3GNT3表达差异上调。通过一系列生化实验，动物实验和临床数据，揭示了N-糖基化的4F2hc与胰腺导管腺癌对铁死亡敏感性的关系。

研究内容

一、整合N-/O-糖蛋白质组学和RNA-seq，发现在PDAC细胞铁死亡期间，N-糖基化的4F2hc和糖基转移酶B3GNT3表达上调。

本研究展开了N-/O-糖蛋白质组学研究，揭示了PDAC细胞经RSL3诱导发生铁死亡的糖蛋白质组特征。在RSL3处理的PANC-1细胞中筛选出7个候选差异蛋白表达糖肽，包括4F2hc、GDF15、ANO6、TFR1、LAMP2、EGFR和CD44。其中4F2hc被广泛报道对铁死亡的防御至关重要，但4F2hc糖基化在铁死亡中的作用尚不清楚。对其糖肽分析表明4F2hc在PDAC中是一个高度N-糖基化的蛋白，其N-糖基化可能在铁死亡的执行中发挥潜在作用。

为了确定哪些糖基转移酶在铁死亡执行过程中对糖基化起始至关重要，本研究对RSL3处理的PANC-1细胞进行mRNA测序，检测糖基转移酶基因的表达。我们鉴定了大约5571个差异表达基因（DEGs），PDAC组织中只有B3GNT3、B3GNT5和ASGR1高表达。其中，B3GNT3和4F2hc具有相互作用关系，且B3GNT3基因表达水平高与PDAC患者预后不良相关。综合结果表明，糖基转移酶B3GNT3可能是铁死亡反应的潜在调节因子，这种调节涉及4F2hc的N-糖基化。

二、大队列PDAC患者中，4F2hc和B3GNT3的表达和预后相关性高。

与癌旁正常组织相比，4F2hc和B3GNT3的蛋白水平在6对PDAC组织中高表达。此外，4F2hc高表达常见于分化较差的PDAC中，B3GNT3的阳性蛋白表达与美国癌症联合委员会（AJCC）III-IV期和T1-2期肿瘤分期的相关性更为显著。值得注意，4F2hc和B3GNT3的高蛋白表达与较低的无进展生存期（PFS）和疾病特异性生存期（DSS）显著相关。

三、4F2hc的N-糖基化在PDAC细胞的铁死亡敏感性中起着关键作用。

研究发现4F2hc基因表达的升高与铁死亡抑制剂如RSL3、ML162和ML210的耐药性呈正相关，特别是在RSL3处理的胰腺癌细胞系中。抑制4F2hc的N-糖基化可以加速其糖蛋白降解。此外，敲除SLC3A2（4F2hc基因名）显著使PANC-1和MIA PaCa-2细胞对RSL3诱导的铁死亡敏感。值得注意的是，经典N-糖基化抑制剂衣霉素处理显著提高了PANC-1和MIA PaCa-2细胞（无论SLC3A2敲低）对RSL3诱导的铁死亡的敏感性。这些结果表明，阻断4F2hc的N-糖基化可以使PDAC细胞对铁死亡敏感。

四、糖基转移酶B3GNT3的缺失增强了PDAC细胞的铁死亡反应。

B3GNT3的敲除显著使PANC-1和MIA PaCa-2细胞对rsl3诱导的铁死亡敏感，并在很大程度上可以被铁死亡抑制剂（如利普司他丁-1，UAMC和维生素E）挽救。与B3GNT3敲除的PANC-1细胞相比B3GNT3过表达显著延迟了4F2hc和GPX4的蛋白衰减，表明过表达具有酶活性的B3GNT3对PDAC细胞中4F2hc和GPX4蛋白的表达有保护作用。结果表明，B3GNT3通过N-糖基化修饰促进非糖基化4F2hc形成为糖基化4F2hc，从而稳定N-糖基化的4F2hc，从而增强4F2hc介导的细胞对铁死亡的抗性。

五、4F2hc的N-糖基化对其蛋白的稳定性至关重要。

从糖蛋白中去除N-聚糖会导致结构不稳定。为了研究N-糖基化是否影响4F2hc的稳定性，对4F2hc的N-糖基化位点进行了突变，并通过DynaMut和PredyFlexy预测了蛋白质的稳定性。结果表明4F2hc的N-糖基化位点的突变可能导致4F2hc蛋白的不稳定性，且N-糖基化突变形式N365Q和4NQ显著降低蛋白质的表达。

六、4F2hc的N-糖基化是其膜定位和与xCT结合所必需的。

4F2hc的去糖基化影响其细胞膜的位置和与xCT的相互作用。首先，在野生型PANC-1和MIA PaCa-2细胞中观察到4F2hc和xCT的共表达和膜共定位，但在TM（N-糖基化抑制剂）刺激细胞中随着CHX处理时间的延长而显著降低。研究进一步证实，在4F2hc缺失的PANC-1细胞中，重组糖基化抗性的N365Q或4NQ突变体并不能挽救4F2hc的膜表达和与xCT的共定位。综上所述，阻断4F2hc的N-糖基化会减弱其膜表达和与xCT的相互作用，从而赋予PDAC细胞对铁死亡的敏感性。

七、N-糖基化抑制剂TM的处理使PDAC细胞对铁死亡敏感。

该部分旨在研究TM在PDAC细胞中的潜在治疗价值并评估TM是否能显著提高PDAC细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。研究表明4种经TM处理的PDAC细胞对RSL3或咪唑酮伊拉斯汀（IKE）诱导的铁死亡比未经TM处理的细胞系更敏感。且在TM+RSL3或IKE联合处理下，PANC-1和MIA PaCa-2细胞的细胞活力显著降低。因此，靶向N-糖基化途径在PDAC的联合治疗中具有巨大的潜力。

八、敲除B3GNT3或敲除SLC3A2延缓了PDAC细胞的生长，并增强了IKE或TM介导的PDAC抑制效果。

本研究通过皮下移植肿瘤（STTs）和原位移植肿瘤（OTTs）实验，检测敲除B3GNT3的潜在抗癌活性。从肿瘤体积和肿瘤生长曲线可以看出，敲除B3GNT3明显减缓了STTs和OTTs的生长。因此，敲除SLC3A2有助于抑制PDAC肿瘤，而与IKE（铁死亡抑制剂）或TM联合使用可显著增强其抗肿瘤活性。

研究总结

本研究通过糖基化蛋白质组学，转录组学筛选出了关键性糖基化修饰蛋白4F2hc及其糖基移酶B3GNT3，并通过一系列的功能性实验和临床证据证明4F2hc的N-糖基化会降低PDAC对铁死亡的敏感性。敲除B3GNT3/SLC3A2或抑制4F2hc的N-糖基化可以提高PDAC对铁死亡的敏感性，该研究提供了双重靶向糖基化和铁死亡的新型治疗策略。