在标准GB 31658.6-2021《动物性食品中四环素类药物残留量的测定 高效液相色谱法》中,采用反相聚合物小柱和磷酸化聚合物小柱配合,以实现动物源性样品深度净化的目的。但在标准的使用过程中,发现了回收率不理想的状况。
经过分析,我们发现目标物的损失可能发生在LCX小柱对四环素类药物的吸附效率上。标准中,提取液先经反相聚合物小柱净化, 然后用6mL甲醇洗脱目标化合物,最后向甲醇洗脱液中加入2mL水稀释后成为下一步LCX小柱的上样液。
从这个操作和SPE小柱的作用原理看,有两方面可能的原因造成吸附效率低。一是上样液有机相比例过大,洗脱能力太强;二是四环素类抗生素离子化不充分,与LCX小柱的磷酸官能团结合效率低。经过多次实验,最终确定将2mL水换成2 mL 8 mM磷酸二氢钠水溶液(pH5.0),通过溶液pH值的调整,增强填料对药物的吸附效率,最终回收率达到要求。
还有一点优化:标准中最后的2mL上机溶液里含有0.4mL的甲醇,检测发现会出现比较强的溶剂效应,所以在改进方法里直接用草酸溶液(0.01 M)定容至2 mL上样检测,消除了溶剂效应。
优化前后前处理方法对比
经过上面两步优化,最后实测猪肉样品,使用固相萃取装置搭配Cleanert PEP-2和Cleanert LCX固相萃取小柱对猪肉样品进行净化和富集,液相色谱检测。实验中400 µg/Kg添加回收率在85%以上,RSD值均小于15%,能够满足标准检测方法要求。因为实验中的基质有土霉素本底,影响了回收率的RSD。
基质加标回收实验结果(n=3)
化合物 | 理论加标浓度 (μg/Kg) | 回收率% | RSD% |
土霉素 | 400 | 102 | 13 |
四环素 | 400 | 94 | 3 |
金霉素 | 400 | 87 | 3 |
多西环素 | 400 | 88 | 2 |
图2. 基质加标色谱图(基质有土霉素本底)
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