DIA定量蛋白质组学助力解析ICP发生的分子机制
●发表单位：广州医科大学
●发表期刊：Cell and Developmental Biology
●影响因子：6.081
●发表时间：2022.07.22
2022年7月22日，广州医科大学夏慧敏团队在Cell and Developmental Biology（IF——6.081）期刊上发表了题为“Comprehensive Analysis of Quantitative Proteomics With DIA Mass Spectrometry and ceRNA Network in Intrahepatic Cholestasis of Pregnancy”的研究论文。该研究揭示核心蛋白—SPI1、FOXK1、SLC13A3和MBD2及其上游lncRNAs和miRNAs可能是缓解ICP患者围产期不良结局的潜在药物靶点。迈维代谢为本次研究提供了DIA定量蛋白质组学检测服务。
妊娠肝内胆汁淤积症（ICP）是一种妊娠特异性疾病，其临床特征是妊娠晚期母体瘙痒和肝功能失调，经常导致围产期的不良结局，包括胎儿窘迫、早产和意外宫内死亡等。目前，关于ICP发生机制的研究报道很少，因此探索ICP导致不良妊娠结局的核心分子非常重要。
长非编码RNA（lncRNA）在多种生物学过程中发挥重要作用。研究表明，血清中三种lncRNAENST00000505175.1、ASO3480和ENST00000449605.1对ICP患者具有诊断价值。然而，关于胎盘lncRNA如何影响胎儿发育和胎盘功能的研究鲜有报道。
miRNA具有广泛的调节功能，如细胞周期、自噬、代谢、免疫和细胞死亡。研究表明，ICP患者尿液外泌体的miR-21、miR-29a和miR-590-3p表达水平显著升高，它们共同抑制ICAM表达，增加ICP发病率。此外，研究人员通过分析尿液中miR-151-3p、miR-300、miR-671-3p和miR-369-5p的表达水平，并构建二元逻辑回归模型，发现这四种miRNA组合对ICP具有良好的诊断价值。然而，miRNA调控ICP进展的潜在机制尚不完全清楚。
在本研究中，通过DIA定量蛋白质组学分析ICP和正常妊娠胎盘中的差异表达蛋白，并构建ceRNA和转录因子调节网络，为改善ICP患者围产期不良结局提供潜在的药物靶点。
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NO.1
ICP大鼠模型构建：雌性大鼠与雄性大鼠交配过夜，发现阴道堵塞定义为第0天。从第13天起，大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇（5 mg/kg），直到第20天，将其命名为ICP组。正常妊娠组（NC组）连续给予等量DMSO治疗。第21天处死怀孕的大鼠，收获胎盘。
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NO.2
蛋白差异表达及功能富集分析：通过DIA定量蛋白质组学筛选差异表达蛋白质，并进行GO、KEGG和COG/KOG功能富集分析。
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NO.3
蛋白互作网络构建以及核心蛋白质筛选：通过STRING、Cytoscape以及Metascape多种数据库绘制差异表达蛋白互作网络，并根据表达差异值选择核心蛋白质。
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NO.4
核心蛋白质的临床意义评估：对核心蛋白质进行组织特异性表达分析，并纳入患者的临床数据进一步分析核心蛋白质与ICP的关联性。
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NO.5
ceRNA和转录因子调节网络构建：结合NetworkAnalyst、PITA、miRanda和TargetScan多种数据库，构建具有临床意义的核心蛋白质的ceRNA和转录因子调节网络。
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NO.6
体外和体内实验模型的验证：从正常妊娠患者获得胎盘，用100μM胆酸刺激48小时构建ICP胎盘模型，并进行体外和体内移植验证。
1.基于定量蛋白质组学的差异表达蛋白质功能富集分析
为了研究ICP和正常妊娠胎盘中的蛋白质表达差异性，本研究通过DIA定量蛋白质组学和显著性标准分析（FC>1.2或FC<0.83，p<0.05），共筛选出77种上调蛋白和99种下调蛋白。GO、KEGG和COG/KOG功能富集分析结果表明，差异表达的蛋白质参与自噬、自噬体形成、辅因子结合、JAK-STAT信号通路以及辅酶转运和代谢。
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图1 基于定量蛋白质组学的差异表达蛋白质功能富集分析
2.从蛋白质-蛋白质相互作用网络预测中选择核心蛋白质
为了分析蛋白质之间的相互作用，通过STRING、Cytoscape以及Metascape多种数据库绘制差异表达蛋白互作网络，并根据表达差异值对蛋白质排序，以选择核心蛋白质。
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图2 从蛋白互作网络中选择核心蛋白质
3.核心蛋白质的表达
蛋白质排序结果表明，前12位上调蛋白是PSAT1、HBG1、HBM、SPI1、PIP4K2B、HBG2、HBE1、FOXK1、YOD1、KRT72、PKLR和SIGLEC6。前12位下调蛋白是HSPA13、EVA1A、EGFL7、SLC13A3、MBD2、TSFM、SP9、GPLD1、GH2、BLOC1S1、F7和MYH7。
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图3 核心蛋白质的表达
4.核心蛋白质的临床意义
为了评估核心蛋白质的临床意义，通过PaGenBase数据库富集分析，结果显示大多数核心蛋白质在组织中呈现特异性表达模式。此外，纳入患者的临床数据进一步分析，包括年龄、分娩胎龄（周）、胎儿体重（g）和核心蛋白的表达，结果显示HBG1、SPI1、HBG2、HBE1、FOXK1、KRT72、SLC13A3、MBD2、SP9、GPLD1、MYH7和BLOC1S1与ICP的发生发展密切相关。
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图4 核心蛋白质呈现组织特异性表达模式
5.ceRNA和转录因子调节网络构建
为了探索具有临床意义的12种蛋白质的调控机制，首先通过NetworkAnalyst数据库构建转录因子-蛋白质网络。结果显示，HBG1、SPI1、HBE1、SP9、GPLD1、BLOC1S1、KRT72和SLC13A3受FOXC1调控；HBG1、HBG2、SPI1和SP9、BLOC11s1、KRT72和SLC13A3受GATA2调控。接着通过PITA,miRanda和TargetScan数据库构建ceRNA蛋白质网络。结果显示，MBD2、SPI1、FOXK1和SLC13A3受多个miRNA和lncRNA调控。
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图5 具有临床意义的12种蛋白质的ceRNA和转录因子调节网络
6.体外和体内实验模型的验证
为了构建ICP模型进行体外和体内实验验证，从正常妊娠患者获得胎盘，用100μM胆酸刺激48小时。HE染色结果显示，与NC组相比，ICP组的胎盘绒毛间隙更窄，胎盘绒毛纤维蛋白坏死增加。WB结果表明，与NC组相比，自噬相关蛋白Beclin1和LC3II/1的表达显著下调，与定量蛋白质组学数据一致。ICP动物模型显示，未成熟胎鼠和胎盘更常见，大多数胎鼠在体外无法存活。然而，在NC组，所有胎鼠发育良好。
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图6 体外和体内实验模型的验证
本研究首次全面分析了10对ICP胎盘的蛋白质图谱，并构建了ceRNA网络。富集分析显示ICP胎盘中的自噬功能被破坏。核心蛋白—SPI1、FOXK1、SLC13A3和MBD2及其上游lncRNAs和miRNAs可能是缓解ICP患者围产期不良结局的潜在药物靶点。KCNQ1OT1和XIST作为一种常见的调控性lncRNA，可能在ICP发展中发挥重要作用，有必要进一步探讨它们的功能。此外，靶向自噬相关蛋白的药物可能是ICP治疗的一个有前途的未来。
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