项目文章 | 转录组和单细胞转录组测序助力解析衰老过程中衰老免疫细胞的积累与棕色脂肪组织功能障碍的相关性

2023年6月2日，中南大学湘雅医院内分泌研究中心罗湘杭和周海燕教授团队，在Nature Communications上发表了题为“Senescent immune cells accumulation promotes brown adipose tissue dysfunction during aging”的研究文章。本文分析了已报道的幼龄和老龄小鼠的BAT单细胞数据，基于挖掘到的信息进一步构建模型小鼠进行了转录组测序，并结合流式细胞术、细胞示踪等实验全面描述了衰老免疫细胞与衰老过程中棕色脂肪组织功能障碍的相关性，并提出S100A8抑制剂-Paquinimod恢复老年小鼠的BAT轴突网络和产热功能的可能性，为恢复由BAT衰老引起的肥胖和与年龄相关的代谢紊乱提供了新的研究视角。欧易生物提供了该项目的转录组测序实验和分析工作。

接下来，我们具体解析一下该项目的研究思路和实验内容。

Result1 scRNA-seq揭示衰老过程中促炎和衰老的S100A8+免疫细胞在BAT中积累

为了确定导致BAT衰老的免疫细胞群，作者分析了已报道的BAT的scRNA-seq数据集，该数据集描述了幼龄（5个月）和老龄（27个月）大鼠与衰老相关的转录景观。作者发现，与年轻大鼠相比，老年大鼠中T细胞和中性粒细胞占比明显增多（图1a），其上调基因主要富集于炎症反应和白细胞-细胞粘附（图1b），且显著高表达S100a8（图1c），这与其炎症反应及白细胞趋化和粘附的上调功能密切相关。进一步发现，S100a8在中性粒细胞中的表达量最高（图1c），且老年大鼠中S100a8⁺的免疫细胞数明显多于年轻大鼠，老年大鼠中S100A8⁺ T细胞的数量约为年轻大鼠的150倍（图1d）。此外，免疫细胞亚型分析结果表明，S100A8可能通过TLR4来调节BAT的产热功能。

流式细胞术和免疫染色均证实，在老年小鼠的BAT中，S100A8⁺ CD3⁺ T细胞和S100A8⁺ CD11b⁺髓系细胞的占比均增加，S100A9⁺ T细胞和髓系细胞浸润也增多了，但其增幅与S100A8⁺免疫细胞相比增长程度较轻（图1h-k）。该结果表明在衰老过程中一类与促炎和衰老相关的S100A8⁺免疫细胞在BAT中积累，可能对BAT的衰老发挥了重要作用。

图1 与促炎和衰老相关的S100A8+免疫细胞随着年龄的增长在棕色脂肪组织中积累

Result2 BAT浸润性S100A8⁺免疫细胞来源于骨髓，其积累抑制了小鼠BAT的生热功能

为了确定BAT浸润S100A8⁺免疫细胞的具体来源，作者将S100a8-Cre-EGFP小鼠中分离出来的造血干细胞或祖细胞（HSPCs）（Lin-Sca^-1⁺c-Kit⁺）静脉移植到2个月大的野生型（WT）小鼠中，生成骨髓嵌合小鼠（图2c，d），分化后表达S100A8的细胞会被GFP标记，结果显示小鼠BAT中GFP的强度在重建后的6个月和12个月均有所增加（图2e）。流式细胞术显示在重建2个月后GFP⁺ CD3⁺ T细胞和GFP⁺ CD11b⁺髓系细胞出现在了BAT中，并在6个月和12个月后逐渐增多（图2f，g）。

图2 BAT浸润性S100A8+免疫细胞来源于骨髓

图3 衰老的S100A8+免疫细胞足以抑制幼龄小鼠的BAT生热功能

Result3 S100A8⁺免疫细胞与交感神经和脂肪细胞结合，形成神经免疫脂肪界面，抑制交感神经支配

为了研究S100A8介导生热的机制，作者用S100A8重组蛋白处理棕色脂肪细胞，并进行了RNA测序，共鉴定出3568个差异表达基因（DEGs）（图4a）。差异基因GO富集分析显示S100A8重组蛋白处理组主要富集在神经元投射调控、神经元凋亡过程、神经元突触可塑性等多种神经元功能相关通路（图4b）。已知交感神经元通过释放去甲肾上腺素在BAT的生热功能中发挥重要作用，这引起了作者对神经元的关注。

作者发现衰老过程中增加的S100A8⁺免疫细胞主要定位于TH⁺和TUBB3⁺交感神经附近（图4c、d）。随着小鼠年龄的增长，TH的荧光强度与S100A8的免疫荧光强度呈负相关（图4e），在S100A8⁺免疫细胞转移的小鼠中，TH、(Ser40) phospho-TH(p-TH)和TUBB3的表达减少，说明交感神经支配受损（图4f）。

以上结果表明，S100A8⁺免疫细胞与交感神经和脂肪细胞相互作用，形成了神经免疫界面，破坏了BAT轴突网络（图4g）。

图4 S100A8⁺免疫细胞与交感神经和脂肪细胞结合，形成抑制交感神经支配的神经免疫脂肪界面

Result4  S100A8抑制棕色脂肪细胞中RBM3的表达，消除了交感神经支配 

作者对S100A8重组蛋白或PBS处理24小时的棕色脂肪细胞进行了RNA-seq测序，并与来自衰老小鼠BAT的数据集（GSE25324）进行了交叉分析，鉴定出22个候选基因（图4h）。其中候选基因Rbm3的表达受寒冷诱导，且在衰老过程中Rbm3表达逐渐降低（图4i）。用S100A8蛋白处理会降低Rbm3的水平（图4j），而RBM3表达降低后，会导致交感神经支配减少，适应性产热功能受损，产热基因水平降低（图4l）和急性冷适应期间体温降低（图4m）。这些结果表明S100A8抑制棕色脂肪细胞中Rbm3的表达，而Rbm3的缺乏将导致能量耗散中断，加速BAT老化。相反，过表达RBM3会延迟BAT衰老，增强耐寒抵抗力（图5a-f）。

接下来作者研究了RBM3调节交感神经支配的机制，对WT和RBM3缺陷的棕色脂肪细胞进行了RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq），筛选909个RBM3靶基因，这些靶基因主要富集于局灶黏附、内吞作用、血小板活化、轴突引导、肌动蛋白细胞骨架等途径(图5g-h)。进一步通过功能回复实验，证实RBM3通过调节Nrp1或Epha7等轴突引导相关基因来调节交感神经支配(图5i-k）。

图5 RBM3介导S100A8+免疫细胞在交感神经支配中发挥作用

Result5 人源化小鼠模型揭示人源S100A8⁺免疫细胞的积累影响了小鼠BAT的衰老

为了研究S100A8⁺免疫细胞与人类衰老的关系，作者收集了年轻人（16-22岁）和老年人（56-69岁）的外周血细胞进行进一步研究。与年轻人相比，老年人的S100A8⁺免疫细胞的比例显著增加（图6a,b）。在人全血细胞中，S100A8的 mRNA水平与p21基因(Kras)表达呈正相关(图6c)。

为了验证积累的人源S100A8⁺免疫细胞是否会引起BAT老化，作者将分离的人S100A8⁺免疫细胞或S100A8⁻免疫细胞转移到2月龄免疫缺陷NOD-SCID (非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷)小鼠中，建立人源化小鼠模型(图6d)。

流式细胞术分析和CD45免疫染色表明，转移的人源S100A8⁺免疫细胞在2周内浸润小鼠BAT(图6f, g)，且转移了人源S100A8⁺免疫细胞的小鼠BAT中TH和UCP1的表达降低(图6g)，P16和P21表达增加，同时β-gal染色增加（图6h,i），冷刺激后BAT生热作用和核心体温降低（图6j,k)。这些结果证明了人源S100A8⁺免疫细胞影响了BAT的衰老，并对其功能形成了障碍。

图6 接种人源S100A8⁺免疫细胞后会诱导小鼠BAT衰老

Result6  Paquinimod破坏S100A8⁺衰老免疫细胞的功能，改善与年龄相关的代谢功能障碍 

S100A8通过TLR4发挥作用，而Paquinimod能阻止S100A8/A9与TLR4结合，是S100A8/A9的选择性抑制剂。作者对15月龄WT小鼠分别给予Paquinimod或对照药后发现，Paquinimod治疗降低了S100A8⁺ T细胞和髓系细胞的浸润(图7a,b)，恢复了BAT的交感神经支配和产热功能(图7c-e)，延缓了BAT的衰老(图7f)，降低小鼠体重(图7g, h)，改善空腹血糖水平(图7i)，增强产热功能，实现代谢稳态(图7j-n)。

图7  Paquinimod可抑制S100A8⁺衰老免疫细胞的功能，改善与年龄相关的代谢功能障碍

【参考文献】

Feng, X., Wang, L., Zhou, R. et al. Senescent immune cells accumulation promotes brown adipose tissue dysfunction during aging. Nat Commun 14, 3208 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38842-6

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排版人：七七

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