背景介绍
对于含有异构体的混合药物多组分分析方法开发时，研究员可能会发现采用单一色谱柱和流动相的组合不能解决分离难题。而串联柱液相色谱法是一种操作简便、成本较低的一维检测手段，可通过两种不同性质的色谱柱串联组合改善分离。然而，从多种串联色谱柱的组合中筛选出具有最佳分离效果的色谱柱组合，并对分离进行优化存在很大的难度，因此在方法开发中采用色谱建模软件辅助方法开发。
实验内容
以华法林及其有关物质混合物，如图1（华法林、6-OH、7-OH、10-OH及其对映异构体）为分离对象，研究色谱模拟软件辅助串联柱色谱法在方法开发中的作用。
图1 华法林及其有关物质混合物（华法林、6-OH、7-OH、10-OH及其对映异构体）
01
分别建立单个色谱柱的
两因素模型
在等度条件下，分别对两种色谱柱（手性柱ChiralPakOD-3、非手性柱Express C18）单独建立有机相比例、柱温两因素数学模型，确认手性-非手性色谱柱联用的可能性。
实验设计
2因素3水平，每根色谱柱9个实验。
30%B；柱温10℃ | 40%B；柱温10℃ | 50%B；柱温10℃ |
30%B；柱温20℃ | 40%B；柱温20℃ | 50%B；柱温20℃ |
30%B；柱温40℃ | 40%B；柱温40℃ | 50%B；柱温40℃ |
mpA：0.1%甲酸水溶液；mpB：0.1%甲酸乙腈溶液；
实验数据分析
对两根色谱柱分别进行有机相比例B%、柱温两因素实验，根据图2所示，较佳的分离条件有相当大的共性，最佳分离条件均为“30%B，20℃”，显示了手性-非手性串联色谱柱用于优化分离的应用潜能。可以将非手性色谱柱放置于手性色谱柱之前，令四对异构体在最佳的分离情况下进入手性色谱柱进行分离。
图2：两因素优化数学模型的可操作空间具备共性
方法重现
软件模型具有良好的预测准确性，实验与模型预测的色谱图，如图3，峰保留时间Δt＜2%，因此，可进一步在等度模型上进行方法优化。
图3 手性和非手性分离模型的最优方法重现图
02
建立手性-非手性串联柱
色谱法的等度模型
基于以上建立单独的分离模型，在等度条件下，即可建立手性-非手性串联柱色谱法的有机相比例、柱温两因素模型，探寻串联柱的最佳分离参数与单个色谱柱最佳分离参数的关联。
实验设计
2因素3水平，共9个实验。
30%B；柱温20℃ | 40%B；柱温20℃ | 50%B；柱温20℃ |
30%B；柱温40℃ | 40%B；柱温40℃ | 50%B；柱温40℃ |
30%B；柱温60℃ | 40%B；柱温60℃ | 50%B；柱温60℃ |
mpA：0.1%甲酸水溶液；mpB：0.1%甲酸乙腈溶液；
实验数据分析
对手性-非手性串联柱色谱法进行有机相比例B%、柱温两因素实验，最佳分离条件为“30%B，20℃”，与单个色谱柱获得的最佳分离参数一致，且串联柱色谱峰保留时间与单根色谱柱峰保留时间的叠加值一致，显示了在等度条件下分别对单根色谱柱建模用于优化串联柱色谱法的有效性。
方法重现
软件模型具有良好的预测准确性，实验与模型预测的色谱图峰保留时间Δt＜2%。然而，等度洗脱面临运行时间过长的问题，仍需进一步通过梯度条件来优化分离。
图4 方法重现图
03
建立手性-非手性串联柱
色谱法的梯度模型
相比于等度洗脱方式，梯度条件对于串联柱色谱法更具挑战，因为组分在第一根色谱柱上的洗脱时间不同，导致组分在第二根色谱柱上经历的实际洗脱程序有差异，增加了方法开发的难度，故借助ACD AutoChrom辅助研究方法开发。
组分在第一根色谱柱上的保留时间直接由软件预测得到，在第二根色谱柱上的保留时间单独计算。
图5 梯度保留时间计算示意图
实验设计
梯度、温度两因素模型，获得最佳分离参数。
模型方法确认重现：
实验数据分析
软件模型具有良好的预测准确性，实验与模型预测的色谱图峰保留时间Δt＜3%，且关注组分色谱峰分离度明显提高（华法林6-OH与10-OH，7-OH与6-OH），验证了计算机软件辅助串联柱液相色谱法在方法开发中的作用。
04
串联柱色谱法在多组分药物混合
物分析方法开发中的实际应用
环肽类混合物（环肽API+其他异构体和降解产物)的传统分析方法采用相同手性固定相柱的串联柱RPLC方法，主峰与异构体之间的分离度较差，故采用手性柱-非手性柱串联的方式，并借助AutoChrom辅助方法开发。
实验设计
有机相比例B%、温度两因素三水平模型。
实验数据分析
最佳分离条件有2个，“28%B，60℃”和“28%B，20℃”。
图6 环肽及其有关物质的梯度温度分离度图
选择最佳条件“28%B，60℃”。
重现方法：各杂质间良好分离，软件模型具有良好的预测准确性，实验与模型预测的色谱图峰保留时间Δt＜3%。再次验证了计算机软件辅助串联柱液相色谱法在方法开发中的作用。
总 结
多组分药物混合物，尤其是含有异构体等杂质时，方法开发难度大，采用串联柱色谱法是一种成本相对较低的检测手段，然而，仅采用两根相同性质的固定相和等度条件，可能导致无法全面地解决分离问题。
如果采用两根不同固定相性质的色谱柱以及梯度洗脱程序，将使方法开发面临巨大挑战，典型难点如下：
方法参数（如pH值、温度、洗脱液组成和梯度程序）需要与所有色谱柱组合兼容，这些参数的选择在很大程度上是通过费力的“随机”实验和“盲目”筛选进行的，方法开发费时费力。
组分在第一根色谱柱上的洗脱时间不同，导致在第二根色谱柱上经历的际洗脱程序有差异，增加了方法开发的难度.
借助色谱模拟软件建模，可以快速预测分析物的色谱保留行为与方法参数之间的关系，极大缩短了分析方法开发时间，使得手性-非手性串联柱色谱法得以扩大实际运用范围。
“
编译者的评论：
本文的选题非常有趣，是一篇很有价值的应用之作。色谱行为的模拟和预判能将色谱研究和应用水平推高到新的高度，期望国内的AutoChrom用户也能有同样的奇思妙想，将分离工作做的出神入化。
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