KIDNEY INT：安徽医科大学药学院与第一附属医院研究团队发现IGFBP7促进急性肾损伤中程序性坏死与炎症的机制

吉凯基因

2022.11.09

作者吉凯基因

TA的动态

急性肾损伤(AKI)是一种病因广泛，破坏性强，以肾功能急剧下降为特征的临床综合征，约10%-15%的住院患者及超过半数的重症患者会受该疾病影响。随着发病率的不断攀升，AKI的早期诊断至关重要，能确保尽早干预或减轻不断发展的肾脏损害。在过去，AKI的诊断主要基于血清肌酐的检测，但对大多数种类的AKI而言，肾小球滤过率降低和肌酐水平升高已属晚期且不敏感的指标。因此，仅依赖血清肌酐水平可能会导致AKI诊疗延误从而导致不良结果。

近年来，新型急性肾损伤生物标志物IGFBP7已被美国食品药品监督管理局批准用于临床不同类型AKI的风险预测。IGFBP7是胰岛素生长因子家族成员之一，不同于家族中其它蛋白1-6，对IGF的结合亲和性较低。与此同时，IGFBP7更是一种存在于AKI患者体循环中的分泌蛋白，人们尚不清楚它是否在AKI进展中起关键调节作用。本研究的结果可能提高我们对IGFBP7在肾损伤中的作用的理解，并为AKI患者开发新的治疗方法提供信息。

2022年6月，安徽医科大学药学院孟晓明教授研究团队在国际期刊《肾脏国际 (Kidney International) 》上发表了题为《胰岛素样生长因子结合蛋白7通过减轻多聚ADP核糖聚合酶1的降解促进急性肾损伤 (Insulin-like growth factor binding protein 7 promotes acute kidney injury by alleviating poly ADP ribose polymerase 1 degradation) 》的研究论文。该研究论文分析了AKI患者、各类动物模型中血清、尿液以及肾脏中IGFBP7的表达变化和定位，通过构建IGFBP7全身性敲除、肾脏条件性敲除小鼠及基因回补实验，发现IGFBP7促进肾脏炎症和程序性死亡的新功能，并通过质谱找到了与IGFBP7相互作用的关键靶蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1（PARP1），并且通过拮抗泛素化E3连接酶环指蛋白4（RNF4），抑制PARP1泛素化降解，促进AKI的发生发展。该研究加深了人们对IGFBP7在肾脏损伤和炎症中功能和机制的认识，也为早期预防和治疗AKI提供了新的思路。

研究方法与结果

1.急性肾损伤中，人肾活检、小鼠模型和TECs模型中IGFBP7表达增加

IHC显示AKI患者组织中IGFBP7水平明显升高，患者血清及尿液样本中IGFBP7也同样如此。血清IGFBP7水平与肌酐水平呈正相关。荧光染色表明顺铂或缺血再灌注诱导的损伤小鼠中IGFBP7水平同样明显升高，且IGFBP7定位于肾小管上皮。两种小鼠模型中血清和尿液IGFBP7水平均升高，且IGFBP7在mRNA和蛋白水平均持续上调。体外研究同样证实了经顺铂和缺氧复氧(H/R)刺激后诱导了IGFBP7产生。与此同时，结果显示顺铂诱导c-Jun的表达具有时间依赖性，过表达c-Jun后显著上调了顺铂诱导的HK2细胞IGFBP7蛋白水平。ChIP实验结果证实，顺铂刺激增强了c-Jun与IGFBP7启动子区域的结合。

2. IGFBP7的减少可预防顺铂、缺血再灌注及脂多糖诱导的肾功能障碍、损伤和炎症

PCR、Western blot和IHC表明IGFBP7全身性敲除小鼠构建成功。PAS染色显示敲除IGFBP7可以减轻顺铂等因素诱导的小鼠肾脏损伤。BUN和血清CRE水平反映了肾脏损伤的严重程度，同样证实了上述结果。IGFBP7敲除后KIM-1蛋白表达明显降低，IHC染色、Western blotting、real-time PCR和TUNEL染色显示，IGFBP7敲除后KIM-1水平降低，炎症细胞因子的产生减少，减弱了p65NF-kB的激活及AKI小鼠模型中的细胞程序性死亡。

3. 条件性敲除IGFBP7可减轻顺铂诱导的肾功能障碍、损伤和炎症

ELISA结果表明条件性敲除IGFBP7的可降低顺铂诱导的AKI模型血、尿中IGFBP7的水平。故在AKI模型中，肾小管上皮细胞可能是IGFBP7产生的最重要来源。电镜观察显示顺铂诱导的IGFBP7 FF组出现质膜破裂、细胞器肿胀、细胞器内容物丢失等病理现象，但在IGFBP7 cKO组得以缓解。同时，IGFBP7 cKO组中KIM-1、炎症细胞因子和程序性细胞死亡水平也下调了。

4. 恢复全敲小鼠中IGFBP7后，顺铂诱导的肾损伤和炎症加重

为了进一步阐明IGFBP7的关键功能，使用IGFBP7过表达腺相关病毒恢复了敲除小鼠中的IGFBP7的表达。恢复IGFBP7表达后增加了BUN、血清CRE水平和肾脏损伤，IHC和Western blotting显示恢复后诱导了KIM-1和炎症细胞因子的产生，并激活p65 NF-kB通路和程序性细胞死亡。

5. IGFBP7与PARP1的BRCT结构域结合，并通过拮抗E3连接酶RNF4抑制PARP1的泛素化

LC-MS/MS结果表明顺铂诱导的HK2细胞中IGFBP7和PARP1结合评分显著升高。Co-IP结果证实IGFBP7与顺铂刺激的HK2细胞中PARP1结合增强，IGFBP7或PARP1过表达后也增强。此外，Co-IP研究了IGFBP7与全长PARP1或各种截断突变体之间的相互作用。结果表明，IGFBP7主要与PARP1的BRCT结构域相互作用。并且IGFBP7通过抑制蛋白酶介导的PARP1降解来增加PARP1的表达。

Co-IP结果确定IGFBP7上调后， PARP1泛素化水平降低。UbiBrowser预测了PARP1的泛素化区域，结果显示泛素E3连接酶RNF4和IGFBP7与PARP1结合区域有大量重叠。特异性泛素E3连接酶RNF4可以靶向类泛素化修饰PARP-1，随后被泛素蛋白酶体系统进行标记降解。IGFBP7上调显著降低了PARP1和RNF4之间的相互作用强度。结果表明IGFBP7通过拮抗E3连接酶RNF4抑制PARP1的泛素化。

结论

总之，结果表明在各种因素诱导的AKI中，IGFBP7在TECs中高度表达，其通过c-jun依赖机制表达升高，同时通过拮抗E3连接酶RNF4增加PARP1的表达，在体内和体外均可加重肾脏炎症和损伤。这项研究强调了新型生物标志物IGFBP7信号通路在多个水平上的药理靶向作用，如抑制IGFBP7/PARP1轴，可能代表未来新的AKI治疗策略等。