解决手性色谱填料“卡脖子”难题－中国手性色谱填料的创新之路

月旭科技

2022.7.21

作者月旭科技

TA的动态

01 手性色谱填料“卡脖子”问题

作为我国色谱填料和色谱柱自主生产型企业，月旭科技很早就涉足手性色谱填料和手性柱的研发和制造，解决了诸多医药行业客户棘手的问题。对于手性色谱填料来说，其中一种关键的原料试剂－直链淀粉，国内大多数厂家和科研机构一直采用进口的试剂。然而，大概在五、六年前，某些进口的直链淀粉试剂突然在中国市场下架，不在中国市场销售，因此造成我们和众多其它使用直链淀粉的公司一样，不得不面对没有这种手性填料关键的原材料可用的地步。大家可能会问，手性色谱填料和色谱柱到底在分离中起多大的作用？小小的直链淀粉试剂竟然能成为“卡脖子”问题？好了，针对大家的疑惑，听我们慢慢道来。

02 手性色谱填料研发的必要性

对于药物分子及其中间体来说，当其碳原子连接四个不同的原子或基团在共价键的作用下会呈现出两种空间结构，这就如物体在镜子里和镜子外一样，物体和其镜像不能完全重合，这种现象叫做手性（chirality，来自于希腊语cheir，意指手，它们像一双手），如图1所示。

图1：典型手性化合物

氨基酸的化学结构

图源 | 网络

手性是自然界的属性，是人类赖以生存的自然界的本质属于之一。生命现象中的化学过程都是在极不对称的环境中进行的，生物大分子如蛋白质、核酸和多糖等，全都有手性特征。例如除细菌以外的蛋白质都是由左旋的L-氨基酸组成；多糖和核酸中的糖则是右旋的D构型。在很多情况下，手性化合物的生理活性、毒性和代谢过程等都存在显著地差异。沙利度胺（thalidomide, 反应停）就是其中一个典型的案例，20世纪60年代它被广泛应用于针对不良妊娠孕妇的治疗，但是后来发现它也会导致孕妇的胎儿畸形，大量的实验结果表明，反应停的(R)-(+)-thalidomide有镇静和安眠的作用，而(S)-(-)-thalidomide不仅没有这种作用反而对胎儿有致畸作用；再比如(S)-构型布洛芬（Ibuprofen）是高效的非甾体解热镇痛药，而(R)-构型布洛芬基本没有药理活性。正因为如此，早在1992年美国食品和药品管理局（FDA）就对手性药物的研究和制备颁布了相关规定，要求在提交手性药物的申请文件时必须要提供单一对映体的药理活性和药代动力学实验的完整报告。市场对手性药物的迫切需求和药品管理当局制定的新规不断刺激着手性药物的研发和制备，预计到2025年，全球药品市场规模将17114亿美元[1]，其中具有单一异构体的手性新药物大约占小分子化学药物的60%，巨大的市场和广阔的发展空间让手性分离技术备受关注，并使手性识别与拆分成为目前科学研究的热点。

图2：2016-2025全球医药市场规模预测趋势图

图源 | 网络

鉴于此，手性化合物的精准拆分对于药物分析具有重要意义。目前，手性化合物的拆分方法主要有化学拆分法、酶或微生物法以及色谱拆分法。其中，色谱法是指利用外消旋化合物中两种单一对映体与手性固定相（chiral stationary phase, CSP）之间的相互作用力不同，使其在色谱系统内的保留时间产生差异，最终达到手性分离。手性色谱拆分的基本原理是基于Dalgliesh教授在1952年提出的“三点相互作用”（three-point interaction）理论。根据这一理论，在一对对映异构体和手性选择剂之间，为了形成稳定性不同的非对映异构体分子络合物而达到手性分离的目的，至少需要三个同时发生的分子间的相互作用力的存在。而且，三点作用力中至少有一个必须是立体化学相互作用，“三点相互作用”的要求不可避免地要从三维空间结构考虑相互的手性识别。色谱法具有极强的手性分离性能，且经色谱拆分后手性化合物的生物活性可以维持不变，而作为拆分手性化合物的色谱柱的核心，手性色谱填料的发展毫无疑问地在提高手性色谱分离的选择性，实现手性化合物分离等方面具有至关重要的作用。

（图片来源：soogif）

人们很早就意识到许多天然产物，特别是糖类的手性性质和可用性，这些化合物可以作为手性对映异构体的分离材料。多糖化合物是自然界含量丰富的具有旋光性的天然聚合物，目前在被开发使用的CSP中，多糖衍生物CSP因其具有识别范围广、负载量高且来源丰富等特点，逐渐成为应用最多、最有效的CSP之一。多糖类手性填料主要包括纤维素、直链淀粉和环糊精以及基于它们的衍生物所制得的高聚物，由于其本身具有高度有序的螺旋结构使其具有优异的手性识别能力，多糖类衍生物手性色谱填料在液相色谱直接拆分对映体方面应用越来越广泛，表1是手性色谱色谱填料的具体分类，由表1可以明显看出，糖类及其衍生物CSP在手性填料中占有举足轻重的地位。

WELCH

表1：手性色谱分离材料的分类

原料来源

分类

具体手性选择试剂

天然物质

低聚糖

二糖、糊精等

多糖

纤维素、直链淀粉、葡聚糖

蛋白

白蛋白、卵清蛋白、酶等

抗生素

万古霉素、替考拉宁等

低分子物质

氨基酸、生物碱等

半合成

改性寡糖

环糊精衍生物、

环糊精聚合物等

改性多糖

纤维素氨基甲酸酯、

淀粉氨基甲酸酯等

改性低分子物质

离子交换试剂

合成

小分子化合物

冠醚、pirkle手性拆分试剂

高分子聚合物

聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯等

目前，多糖类衍生物手性色谱填料以纤维素和直链淀粉苯基氨基甲酸酯类衍生物手性固定相应用得最为广泛，其中，尤其以日本大阪大学 Okamoto教授课题组对其研究最为深入。早在1984年Okamoto[2,3]课题组就将纤维素衍生物通过物理方法涂敷在硅胶表面形成聚合物包覆硅胶薄膜，克服了微晶纤维素三乙酯（MCTA）作为 CSP 的机械稳定性差问题。在随后的工作中Okamoto教授课题组又合成了一系列的纤维素和直链淀粉衍生物，将其均匀地涂敷到硅胶上制得CSP，彻底解决了手性填料的机械强度低、稳定性差等问题。到目前为止，市场上使用频率最高的就是日本一家著名手性色谱柱公司的“四大金刚”多糖类手性色谱柱，具体型号为正相的AD-H、AS-H、OD-H和OJ-H、反相的AD-RH、AS-RH、OD-RH和OJ-RH，大概可以解决市场上90%左右的手性化合物的拆分问题，体现出非常优异的分离效果。

（图片来源：soogif）

到目前为止，全球手性色谱填料基本上是由这家日本手性色谱柱公司所垄断，当其它常规反相C18色谱柱每根只卖几千元人民币时，一根装有3克左右手性填料的色谱柱价格超过1万元人民币，国内进行不对称有机合成的科研机构和公司每年都要花费高昂的经费在手性色谱柱的采购上。另外，如果需要采用手性制备柱进行分离纯化从而得到单一的对映体目标物产品，那就花费更高，因为一根手性制备柱的价格往往超过10万元人民币。对于色谱填料厂家而言，生产一公斤的手性色谱填料，装成柱子后常常可以卖到几百万人民币的价格，其产品附加值非常高。尽管如此，手性色谱柱的寿命却远远不如常规色谱柱的寿命长，特别是涂覆型的手性分离材料，特别“娇贵”！也正是因为手性色谱填料的高额利润使得世界许多色谱公司和科技精英纷纷去挑战这些技术，但由于手性色谱分离技术壁垒之高及产品产业化难度巨大，至今都无法撼动这家日本手性色谱填料公司的垄断地位。

03 手性色谱填料国产化－解决

“卡脖子”技术的必由之路

多糖类手性色谱填料主要是通过在全多孔硅胶微球上涂覆或键合带有手性识别位点的多糖如纤维素、直链淀粉和环糊精等高分子聚合物等。为了达到对映异构体拆分的目的，涂覆或键合后的纤维素和直链淀粉必须保持手性结构环境，使得对映异构体和手性分离材料之间具有“三点相互作用”。遗憾的是，纤维素、直链淀粉和环糊精等多糖类衍生物的手性结构容易在涂覆或键合过程中受到破坏，因此制备多糖类手性色谱填料不仅对硅胶微球基质要求高，对涂覆或键合工艺的要求往往更高，且对多糖类物质的本身的结构例如颗粒大小、聚合度、分子量以及衍生衍生物功能基团均有极高的要求，因此多糖类手性色谱填料的制备技术壁垒极高，目前中国市场的手性分离填料和色谱柱基本以进口品牌为主，很少有国产厂家能够规模化制备。中国拥有世界上最大的色谱技术科研团队和应用团队，我们利用色谱技术发表的SCI论文早在2011年就已经超越了美国，位居全球第一。但遗憾的是，这些科研论文绝大多数采用的色谱填料和色谱柱是进口品牌。主要原因是色谱填料技术壁垒高、产业化周期长、对材料本身的稳定性和重现性要求极高。由于色谱技术主要是用于做精准的定性、定量或者分离纯化某些高附加值目标物，一个很现实的问题是客户样品的价值往往远高于一根小小柱色谱柱的价值，并且，一旦出现偏差，客户需要进行大量的OOS（检验结果偏差）偏差调查，费时费力。所以客户轻易不敢更换色谱填料和色谱柱的品牌。

（图片来源：soogif）

淀粉是一类分布广泛的多糖，也是D-(+)-葡萄单元组成，它的结构比纤维素更为复杂，化学结构如图3所示。淀粉由大约20%的直链淀粉（amylose）和80%的支链淀粉（amylopactin）组成，只是直链淀粉是线性聚合物，支链淀粉是由C1-C6连接的分支形聚合物。

图3：淀粉的化学结构

对于手性填料特别是直链淀粉修饰的手性填料来说，其最大的挑战不在于基质硅胶微球的性能，而在于关键的原材料－直链淀粉本身的理化性质和涂覆或者键合工艺，因为多糖类的手性色谱填料的拆分机理仍然主要是靠“三点相互作用”，而具有手性识别功能的直链淀粉例如颗粒度大小、聚合度、分子量分布等参数当仁不让地会影响最终的拆分效果。目前，中国市场上90%以上的手性柱市场由一家日本公司垄断，他们的手性柱甚至成为了世界标准，他们甚至在产品资料上明确地写上“手性色谱柱分离世界标准”，这是非常自豪的事情！但是，这并不代表国产的色谱柱公司经过多年的技术积累无法接近或者达到这些进口的手性色谱填料公司的产品。尤其在如今现在中国面临发达国家“卡脖子”技术的大环境下，这就更加需要我们国内的科技型公司脚踏实地地做好产品研发和技术探索，就拿本文讨论的手性填料的关键原材料－直链淀粉来说，虽然多糖类化合物例如纤维素和直链淀粉都是极为常见的物质，市场直链淀粉的种类也很多。但是，经过深入研究发现，全世界只有日本一家公司的直链淀粉原料可以满足做手性填料的需求，但其价格超乎一般人的想象，每公斤直链淀粉的价格高达60万元人民币。并且，非常遗憾的是近些年该直链淀粉已经不在中国市场上销售，这就导致了国内一些做色谱填料的公司和研究团队面临着无原料可用的地步，极大程度地影响了科研进展。并且，我们经过研究发现，即使使用该公司供应的直链淀粉原材料，做出来手性填料也无法达到前述所提到的这家日本公司的手性填料的分离效果。这就再次证明，关键的高科技技术产品，靠买是买不来的，一定要靠国内众多的科研人员脚踏实地地去研究，一步步突破才行。

（图片来源：soogif）

从手性分离材料开发的过程中我们可以发现这家日本手性填料公司对上下游产业链及其核心原材料的掌控程度达到让人惊叹的地步，日本上下游厂家的紧密配合也非常值得我们学习。这也是为什么这么多年全世界其它公司都无法撼动日本这家日本公司在手性材料的垄断地位的重要原因。有关数据表明，日本制造业一直走在世界前列，在256个领域拥有全球6成以上份额。2018年全球创新100强的企业中，日本有39家。例如成立于1956年的发那科，富士山脚下的黄色巨人，是世界上最大的机器人公司，也是世界上最大的专业数控系统生产厂家，占据了全球70%的市场份额。表面上看，很多日本企业正在退出某些市场，其实是这些企业在转型升级到更高精尖的领域。日本企业在产品制造过程中上游领域的实力强劲，掌握化工及电子材料、零部件、精密设备及仪器等关键产品和技术，占据了产业链上游的优势地位，是毫无争议的“隐形冠军”！日本之所以会控制很多产业的关键材料和技术不是因为他们比其它国家的人更聪明，而是日本人有足够的耐心、他们具有坚持不懈的精神及其精益求精的工匠精神，促使他们可以把先进技术做到极致，这也是我们最该向日本人学习的地方。

（图片来源：soogif）

月旭科技针对直链淀粉这一“卡脖子”难题，立足于手性分离具体的需求进行研发。一开始我们也不断地质疑自己是否能够解决该问题，全球这么多色谱同行都无法解决适合手性填料用直链淀粉原材料的问题，凭什么月旭科技就能解决？因为我们这么多年遇到了太多的挫折，也和国内很多知名的科研机构和高校进行合作，想着依靠外界的力量克服这一难题，但无一例外都失败了。最后，实在没有办法，我们只能自己一步步的去探索来解决这个难题，虽然我们团队几乎没有人熟悉食品化学领域内的知识，更谈不上我们对直链淀粉有多么深刻的认知，但是我们的研发团队本着“笨鸟先飞”的态度，就是想着学习德国、日本这些发达国家的“工匠精神”，一种种实验方案去试验、去摸索，最后经过多年的持续努力终于研发出适合做手性材料原料的直链淀粉（如图4所示），说实话看到比较完美的结果那一刻我们整个研发团队是懵的，有那么一种强烈的“幸福来得太突然”的感觉！这种经历也深刻地告诉我们：哪怕是在小小的色谱行业，欧美、日本等发达国家能做好的事情，我们也一定能做好，哪怕是我们笨一点、慢一点，但只要我们坚持不懈，永不放弃攀登色谱分离材料研究的高峰，就没啥不可能实现的目标！这个卡脖子难题的克服，也让我们整个团队意识到：把一件看似微不足道、很平常的事情做好；把一个很普通的问题实实在在的去解决，就是最大的创新！创新的东西一定要为人类服务，一定要发挥它的价值，真正为国家、为人民做出贡献。就像前些年我们都熟悉的一个案例：在圆珠笔的制造方面，中国已经成为当之无愧的制笔大国，每年生产几百亿支，但一连串值得骄傲的数字背后，却是核心技术和材料高度依赖进口，大量的圆珠笔笔头的“球珠”和“球座体”还需要进口，无论是生产设备还是原材料，长期以来都掌握在瑞士、日本等国家手中。但是，中国的相关行业公司和科研机构经过大量的努力，终于打破了进口的垄断，取得了巨大的成功！所以，现如今越来越多的案例说明，中国的企业只要立足于科技创新，一个个难题去脚踏实地的克服，我们一定能为祖国的建设添砖加瓦，中华民族一定能实现伟大复兴！

图4：月旭科技开发的手性填料的

核心原材料直链淀粉样品图

月旭科技之所以能突破直链淀粉手性色谱填料的生产技术这一难题，充分证明了持之以恒、坚持不懈的重要性。即使看上去再遥不可及的目标，只要我们本着愚公移山的精神，就有实现的可能，笨一点有什么关系？月旭科技的研发团队就是凭借这种坚持不懈的精神突破了手性填料用的关键原材料直链淀粉的产业化制备的“卡脖子”难题，彻底解决了直链淀粉自主供应的问题，并解决了涂覆工艺不均匀、装柱不稳定等问题，最后生产出高性能的直链淀粉手性色谱填料和色谱柱。目前，我们不仅可以提供高性能的直链淀粉手性色谱填料，而且可以为有手性制备纯化需求的客户提供全套的解决方案，我们也具备生产毫克级到到公斤级甚至百公斤级的手性填料的生产能力。图5是月旭科技基于纤维素和直链淀粉开发的四种涂覆性的手性分离材料，并以日本进口公司的质检标准进行测试，其分离性能基本接近日本公司的分离性能，其分离度达到了18-20（以反-二苯乙烯氧化物，trans-Stilbene oxide为例），其拆分效果的色谱图如图6所示。图7是月旭手性色谱柱应用于一些手性化合物拆分的分离效果图谱，从图中可以明显看出具有优异的分离效果，均实现了基线分离。

纤维素衍生物型：

表面涂覆了纤维素衍生物的高纯球形硅胶

Cellu-D/ Cellu-DR:

纤维素-三（3,5）

二甲基苯基氨基甲酸酯

Cellu-J/ Cellu-JR:

纤维素-三

[4-甲基苯基甲酸酯]

直链淀粉衍生物型：

表面涂覆了直链淀粉衍生物的高纯球形硅胶

Amy-D/ Amy-DR:

直链淀粉-三（3,5）

二甲基苯基氨基甲酸酯

Amy-S/ Amy-SR:

直链淀粉-三[(S)-α-

甲基苯基氨基甲酸酯]

图5：月旭科技开发的四种涂覆型色谱柱

图6：月旭直链淀粉手性色谱柱标准测试色谱图

Mobile phase: n-Hexane/Isopropanol=90/10; Fow rate: 0.5ml/min; Temperature: Ambient (Nominally 23℃); Detector: 254nm; Injection Volume: 10µl

图7：月旭手性色谱柱的对一些手性外消旋体

的拆分效果

WELCH

月旭科技手性色谱柱产品资料

Cellu-D

正相

5μm、

10μm

纤维素-三（3,5）

二甲基苯基氨基甲酸酯

L40

Cellu-DR

反相

Cellu-J

正相

5μm、

10μm

纤维素-三

[4-甲基苯甲酸酯]

L80

Cellu-JR

反相

Amy-D

正相

5μm、

10μm

直链淀粉-三（3,5）

二甲基苯基氨基甲酸酯

L51

Amy-DR

反相

Amy-S

正相

5μm、

10μm

直链淀粉-三[(S)-

α-甲基苯基氨基甲酸酯]

Amy-SR

反相

订货信息

参考文献

[1]中商情报网.https://www.askci.com/news/chanye/20211224/1015011701874.shtml

[2] Ichida A., Shibata T., Okamoto I., et al. Resolution of enantiomers by HPLC on cellulose derivatives [J]. Chromatographia, 1984, 19(1): 280－284.

[3] Okamoto Y., Kawashima M., Yamamoto K., et al. Chromatographic resolution .6. useful chiral packing materials of high-performance liquid-chromatographic resolution –cellulose triacetate and tribenzoate-and tribenzoate coated on macroporous silica-gel[J]. Chem Lett, 1984, (5): 739－742.

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